ANFOTERICINA B CONVENCIONAL ASSOCIADA AO ÁCIDO GÁLICO E AO ÁCIDO ELÁGICO EM FORMULAÇÃO TÓPICA PARA TERAPIA ANTILEISHMANIA

Abstract

RESUMO As leishmanioses são zoonoses parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania, pertencentes ao grupo de doenças tropicais negligenciadas. São de difícil controle, não há vacina eficaz e o seu tratamento é baseado em um número limitado de drogas que apresentam uma gama de efeitos indesejáveis, além de já existirem relatos de resistência à essas drogas. O desenvolvimento de novos medicamentos demanda tempo e grandes investimentos financeiros e, tendo em vista essa limitação, a associação farmacológica de fármacos convencionais e a introdução de novas moléculas e tecnologias no desenvolvimento de novas formulações tem despertado interesse de pesquisadores. Neste estudo, demonstramos o efeito de associação da anfotericina B (Anf B) convencional e ácido gálico (AG) ou ácido elágico (AE) em formulação tópica de Gel de Polaxamer 407®. O AG e o AE são dois imunomoduladores naturais anteriormente estudados por nosso grupo e já reportamos sua ação antileishmania e potencial em modular a resposta imune. Foram realizados testes de estabilidade preliminar e de liberação in vitro dos fármacos nas formulações de Anf B, AG, Anf B + AG, AE e Anf B + AE na composição e tratamento in vivo de camundongos BALB/c infectados por L. major. Passados 40 dias da infecção, os animais foram divididos em 6 grupos, tratados 2x/dia, durante 21 dias com os géis de Anf B, AG, Anf B + AG, AE e Anf B + AE e o grupo controle negativo tratado com o veículo (polaxamer 407®). Os animais foram avaliados clinicamente mensurando-se o tamanho das lesões 1x/semana. Ao termino do tratamento e 14 dias após, os animais foram eutanasiados para avaliação ex vivo quanto à redução da carga parasitária no local da lesão e ativação de resposta imune celular, por meio da retirada de macrófagos peritoneais para avaliar sua ativação por capacidade fagocítica, atividade lisossomal, quantificação de nitrito e cálcio intracelular. Também foi realizado a infecção in vitro dos macrófagos peritoneais dos animais tratados com as formulações para avaliar o índice de sobrevivência de amastigotas internalizadas e o percentual de macrófagos infectados. Todas as formulações apresentaram-se estáveis no tempo T0 nos testes preliminares, sendo a formulação de AG a que houve maior liberação in vitro, seguido de AE e das formulações combinadas de Anf B + AG e de Anf B + AE. Houve efeito da associação entre Anf B e AG e Anf B e AE em todos os ensaios realizados. Nos animais que receberam tratamento houve redução do tamanho da lesão e redução da carga parasitária. O tratamento com as formulações contendo AG e AE foram capazes de ativar macrófagos em todos os parâmetros avaliados, bem como reduziram a quantidade de macrófagos infectados e o número de amastigotas por macrófago, indicando, portanto, ação terapêutica e ativação da resposta imune, levando a cura e proteção. O AG e AE produziram efeito de associação com a Anf B, o que torna promissor no tratamento da leishmaniose. ABSTRACT Leishmaniasis are parasitic zoonoses caused by protozoa of the genus Leishmania belonging to the group of neglected tropical diseases. It is difficult to control, there is no effective vaccine and its treatment is based on a limited number of drugs that have a range of undesirable effects, and there are already reports of resistance to these drugs. The development of new drugs requires time and large financial investments, in view of this limitation, the pharmacological association of conventional drugs and the introduction of new molecules and technologies in the development of new formulations has aroused interest of researchers. In this study we demonstrated the synergistic effect of the combination of conventional amphotericin B (Anf B) and natural molecules, gallic acid (GA) and ellagic acid (EA) in topical formulation of Polaxamer 407® Gel. GA and AE are two natural immunomodulators previously studied by our group and have already reported their antileishmania action and potential in modulating the immune response. Preliminary stability tests and in vitro release of the drugs were formulated in the formulations of Anf B, GA, Anf B + GA, EA and Anf B + EA in the composition and in vivo treatment of L. major infected BALB/c mice. After 40 days of infection, the animals were divided into 6 groups, treated 2x/day for 21 days with the gels of Anf B, GA, Anf B + GA, EA and Anf B + EA and the negative control group treated with vehicle (polaxamer 407®). The animals were evaluated clinically by measuring the lesion size 1x/week. At the end of the treatment and 14 days later, the animals were euthanized for evaluation of the ex vivo assays for the reduction of the parasite load at the lesion site and activation of the cellular immune response, by the removal of peritoneal macrophages to evaluate its activation by phagocytic capacity , lysosomal activity, quantification of nitrite and intracellular calcium. In vitro infection of the peritoneal macrophages was also performed to evaluate the survival rate of internalized amastigotes and the percentage of infected macrophages. All formulations were stable at time T0 in the preliminary tests, the GA formulation being the most liberated in vitro, followed by AE and the combined formulations of Anf B + GA and Anf B + EA. There was synergism between Anf B and GA and Anf B and EA in all the tests performed. In the animals that received treatment there was reduction of the size of the lesion and reduction of the parasitic load. The formulations containing GA and EA activated macrophages in all evaluated parameters, as well as reduced the amount of infected macrophages and the number of amastigotes by macrophage, indicating, therefore, therapeutic action and activation of the immune response, leading to healing and protection. GA and EA produced a synergistic effect with Anf B, which makes this association promising in the treatment of leishmaniasis.