DETECÇÃO DE METALOPEPTIDASES TIPO GP63 EM Leishmania infantum RECUPERADAS DE GATOS NATURALMENTE INFECTADOS

Abstract

RESUMO A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania. Os gatos têm surgido como potenciais reservatórios de diferentes espécies de Leishmania, apesar de anteriormente serem considerados refratários à infecção. A maioria dos gatos infectados permanece saudável, possivelmente devido à sua resistência natural. A molécula gp63 é considerada um fator de virulência encontrada na superfície de promastigotas de todas as espécies de Leishmania. A gp63 é uma metalopeptidase de 63 kDa, que facilita a internalização do parasito em macrófagos, bem como sua nutrição, crescimento, diferenciação e escape do sistema imune. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de metalopeptidases, com ênfase na gp63, em promastigotas de Leishmania infantum isoladas de gatos naturalmente infectados na cidade de Teresina, Piauí. Extratos celulares de promastigotas foram obtidos através da lise com Triton X-100 a 0,1% e subsequentemente usados para detectar a metalopeptidase gp63. O sobrenadante de cultivo livre de células foi concentrado em um sistema Centricon, utilizando uma membrana de 10 kDa. A atividade proteolítica dos extratos celulares e sobrenadantes de L. infantum foi avaliada utilizando o substrato peptídico fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC a pH 10 por 60 minutos. No extrato celular, as cepas demonstraram uma atividade enzimática variando entre 2.600 e 100 Unidades Arbitrárias de Fluorescência (UAF). Já no sobrenadante, a atividade enzimática mensurada encontrou-se na faixa entre 800 e 100 UAF. Além disso, a presença de 1,10fenantrolina (um inibidor clássico de metalopeptidases) inibiu a atividade dessas enzimas, sugerindo que se tratavam de metalopeptidases. Realizamos ensaios zimográficos para evidenciar a atividade enzimática da gp63, utilizando SDS-PAGE com gelatina incorporada como substrato. Após eletroforese, os géis foram incubados em tampão pH 10,0 e pH 5,0 por 48 horas a 37°C, com ou sem 10 mM de 1,10-fenantrolina. No extrato celular e no sobrenadante, foi observada uma degradação proteolítica em torno de 63 kDa, correspondente à enzima gp63, previamente identificada e caracterizada em diversas espécies de Leishmania, com um pH ótimo de 5,0. A atividade enzimática no extrato celular foi completamente inibida na presença de 1,10-fenantrolina indicando, novamente, a natureza metalopeptidásica da enzima. Por outro lado, no sobrenadante, não foram detectadas atividades enzimáticas, provavelmente devido a quantidade reduzida desta enzima. A detecção de gp63 foi também realizada através de Western blotting usando o anticorpo anti-gp63, tanto no extrato celular quanto no sobrenadante. No extrato celular, foram observadas bandas com massas moleculares variando entre 45 a 100 kDa. Enquanto isso, no sobrenadante, as cepas apresentaram um perfil reativo com bandas entre 63 kDa e 120 kDa. Na análise por citometria de fluxo, promastigotas foram fixadas com paraformaldeído e incubadas com o anticorpo primário anti-gp63, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado a fluoresceína, para quantificar a expressão de gp63 nos diferentes isolados. A análise foi realizada tanto para a detecção da gp63 localizada na superfície celular quanto no interior da célula. Observou-se que o porcentual de células marcadas variou de 51% a 96% na superfície celular e de 46% a 95% no interior das promastigotas. Além disso, foi notada uma maior intensidade de fluorescência no interior celular entre 8000 a 2000 MIF, em comparação com a superfície celular que variou de 6000 a 2500 MIF. Em conclusão, nossos resultados indicam a presença de metalopeptidases com domínios homólogos à gp63 em promastigotas de L. infantum isolados de gatos. Essa descoberta aponta para potenciais implicações na virulência e na resposta imunológica do hospedeiro, destacando a importância deste estudo para uma compreensão mais aprofundada da leishmaniose em felinos.

ABSTRACT Leishmaniasis is a disease caused by protozoa of the genus Leishmania. Cats have emerged as potential reservoirs of different species of Leishmania, despite previously being considered refractory to infection. Most infected cats remain healthy, possibly due to their natural resistance. The molecule gp63 is considered a virulence factor found on the surface of promastigotes of all Leishmania species. Gp63 is a 63 kDa metallopeptidase that facilitates the parasite internalization into macrophages, as well as its nutrition, growth, differentiation and evasion of the immune system. The aim of this study was to investigate the presence of metallopeptidases, with emphasis on gp63, in promastigotes of Leishmania infantum isolated from naturally infected cats in the city of Teresina, Piauí. Cellular extracts of promastigotes were obtained by lysis with 0.1% Triton X-100 and subsequently used to detect the metallopeptidase gp63. The cell-free culture supernatant was concentrated using a Centricon system with a 10 kDa cut-off membrane. The proteolytic activity of L. infantum cellular extracts and supernatants was evaluated using the fluorogenic peptide substrate Z-Phe-Arg-AMC at pH 10 for 60 minutes. In the cellular extract, the parasite strains demonstrated enzymatic activity ranging between 2,600 and 100 Arbitrary Fluorescence Units (AFU). In the supernatant, enzymatic activity ranged from 800 to 100 AFU. Additionally, the presence of 1,10-phenanthroline (a classic metallopeptidase inhibitor) blocked the activity of these enzymes, suggesting they were metallopeptidases. We conducted zymographic assays to demonstrate the enzymatic activity of gp63, using SDS-PAGE with gelatin incorporated as the substrate. After electrophoresis, the gels were incubated in buffer at pH 10.0 and pH 5.0 for 48 hours at 37°C, with or without 10 mM 1,10-phenanthroline. Proteolytic degradation around 63 kDa, corresponding to the gp63 enzyme previously identified and characterized in various Leishmania species, was observed in the cellular extract and supernatant, with an optimal pH of 5.0. Enzymatic activity in the cellular extract was completely inhibited in the presence of 1,10-phenanthroline, indicating again the metallopeptidase nature of this enzyme. However, no enzymatic activities were detected in the supernatant, likely due to the reduced amount of this enzyme. The detection of gp63 was also performed by Western blotting using anti-gp63 antibody, both in the cellular extract and supernatant. In the cellular extract, bands with molecular masses ranging from 45 to 100 kDa were observed, while in the supernatant, strains exhibited a reactive profile with bands between 63 and 120 kDa. Flow cytometry analysis was conducted, where promastigotes were fixed with paraformaldehyde and incubated with primary anti-gp63 antibody, followed by incubation with fluorescein-conjugated secondary antibody, to quantify gp63 expression in different isolates. The analysis was performed for both surface and intracellular gp63 detection. It was observed that the percentage of labeled cells ranged from 51 to 96% on the cell surface and from 46 to 95% inside the promastigotes. Additionally, a higher fluorescence intensity was noted inside the cell ranging from 8000 to 2000 MFI, compared to the cell surface which ranged from 6000 to 2500 MFI. In conclusion, our results indicate the presence of metallopeptidases with domains homologous to gp63 in L. infantum promastigotes isolated from cats. This discovery points to potential implications in host virulence and immune response, highlighting the importance of this study for a deeper understanding of leishmaniasis in felines.