INFECÇÃO POR Leishmania infantum ALTERA A HISTOARQUITETURA E A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS NAS GLÂNDULAS SALIVARES

Abstract

RESUMO A leishmaniose visceral é um grave problema de saúde pública que, anualmente, faz milhares de vítimas no mundo inteiro. Provoca uma infecção sistêmica capaz de atingir qualquer órgão devido à intensa propagação das células contaminadas por meio da corrente sanguínea. A confirmação do DNA de Leishmania sp. na saliva favorece o interesse de pesquisas sobre os efeitos da infecção provocada pelo parasito nas glândulas salivares. Mesmo com os intensos avanços, o conhecimento das alterações estruturais causada pela infecção por Leishmania infantum nas glândulas salivares ainda é escasso. Por isso, o objetivo dessa pesquisa foi identificar alterações estruturais nas glândulas salivares de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com L. infantum. A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais (protocolo nº 719/2022). Foram usados 24 camundongos BALB/c machos, divididos randomicamente em dois grupos, com 12 animais cada. No grupo experimental em cada camundongo foi inoculado 76µL, via intraperitoneal, com 1x10 6 promastigotas metacíclicas de L. infantum em Solução Salina Tamponada Fosfato (PBS). Em cada animal do grupo controle, para simular a mesma situação de estresse, foi administrado 50µL de PBS. Aos 7 e 50 dias de infecção, 6 animais de cada grupo foram eutanasiados para a coleta das amostras. Coletaram-se as glândulas salivares que foram, em seguida, submersas em solução de formaldeído 10% tamponado para fixação. Essas amostras foram processadas histologicamente e coradas com hematoxilina e eosina. O fígado e o baço também foram removidos, fixados, processados e corados histologicamente para confirmar a infecção. As lâminas contendo tecido salivar foram analisadas qualitativamente e quantitativamente, por meio da histomorfometria. Os dados foram tabulados e analisados estatisticamente. As amostras glandulares também foram analisadas através da técnica de imuno -histoquímica, usando anticorpos anti-Ki-67 e anti-Bcl-2. Além disso, as glândulas salivares foram submetidas à extração de DNA e à técnica de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). O modelo proposto no desenvolvimento da infecção foi eficaz, observando a presença de formas amastigotas da L. infantum e alterações histopatológicas no fígado e no baço. As glândulas salivares apresentaram alterações microestruturais após a infecção experimental. Aos 7 dias de infecção, foram identificados hiperemia, vacuolização citoplasmática, hipercelularidade de células acinares e ductais e alterações no tamanho dos ácinos. Aos 50 dias de infecção, o tecido salivar apresentou perda da homogeneidade tecidual, regiões com intensa desordem celular e vacuolização citoplasmática. A glândula sublingual, após a infecção, apresentou um crescimento expressivo do volume acinar confirmado pela histomorfometria. Além disso, houve alteração na expressão de Ki-67 e BCL-2 nas glândulas analisadas, com a intensa expressão de Ki-67 aos 7 dias de infecção e de Bcl-2 50 dias após a infecção. Não foi identificada a presença do DNA do parasito no tecido das glândulas analisadas. Portanto, a histoarquitetura das glândulas salivares é alterada após a infecção experimental por L. infantum e as mudanças ocorridas devem-se ao processo inflamatório sistêmico provocado pela infecção.

ABSTRACT Visceral leishmaniasis is a serious public health problem that claims thousands of victims worldwide every year. It causes a systemic infection capable of reaching any organ due to the intense spread of contaminated cells through the bloodstream. Confirmat ion of Leishmania sp. in saliva favors research interest into the effects of the infection caused by the parasite in the salivary glands. Even with intense advances, knowledge of the structural changes caused by Leishmania infantum infection in the salivary glands is still scarce. Therefore, the objective of this research was to identify structural changes in the salivary glands of BALB/c mice experimentally infected with L. infantum. The research was approved by the Ethics Committee on the Use of Animals (protocol nº 719/2022). 24 male BALB/c mice were used, randomly divided into two groups, with 12 animals each. In the experimental group, each mouse was inoculated 76µL, intraperitoneally, with 1x10 6 metacyclic promastigotes of L. infantum in Phosphate Buffered Saline Solution (PBS). To simulate the same stress situation, each animal in the control group was administered 50µL of PBS. At 7 and 50 days of infection, 6 animals from each group were euthanized for sample collection. The salivary glands were colle cted and then submerged in a 10% buffered formaldehyde solution for fixation. These samples were histologically processed and stained with hematoxylin and eosin. The liver and spleen were also removed, fixed, processed, and histologically stained to confirm infection. The slides containing salivary tissue were analyzed qualitatively and quantitatively, using histomorphometry. The data were tabulated and statistically analyzed. The glandular samples were also analyzed using the immunohistochemistry technique, using anti-Ki-67 and anti-Bcl-2 antibodies. Furthermore, the salivary glands were subjected to DNA extraction and the Real -Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique. The proposed model in the development of the infection was effective, observing the presence of amastigote forms of L. infantum and histopathological changes in the liver and spleen. The salivary glands showed microstructural changes after experimental infection. At 7 days of infection, hyperemia, cytoplasmic vacuolization, hypercellularity of acinar and ductal cells and changes i n the size of the acini were identified. At 50 days of infection, the salivary tissue showed loss of tissue homogeneity, regions with intense cellular disorder and cytoplasmic vacuolation. The sublingual gland, after infection, showed a significant growth in acinar volume confirmed by histomorphometry. Furthermore, there was a change in the expression of Ki -67 and BCL-2 in the glands analyzed, with intense expression of Ki -67 at 7 days of infection and of Bcl-2 50 days after infection. The presence of the parasite's DNA was not identified in the tissue of the glands analyzed. Therefore, the histoarchitecture of the salivary glands is altered after experimental infection by L. infantum and the changes that occur are due to the systemic inflammatory process caused by the infection.