EFEITO DO β-CARIOFILENO E ÁCIDO ELÁGICO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO

Abstract

RESUMO: A criopreservação de sêmen oferece grandes vantagens para os programas de reprodução ovina, promovendo ganho genético. No entanto, a criopreservação causa crioinjúrias e reduz a qualidade espermática, devido principalmente ao excesso na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) promovendo uma diminuição da motilidade espermática observada após o processo de descongelação. Isso se reflete nos baixos índices de fertilidade das fêmeas inseminadas com sêmen pós-descongelado quando comparados ao sêmen fresco. Porém, isso pode ser melhorado a partir de avanços nas biotécnicas reprodutivas e, principalmente, com as melhorias dos diluidores de preservação de sêmen. É importante pesquisas para avaliar os efeitos de novas substâncias antioxidantes para serem adicionados no diluidor convencional de criopreservação de sêmen, a fim de proteger as células espermáticas desse desequilíbrio na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Pressupõe-se que o β-cariofileno (BC) e Ácido elágico (AE), ambos antioxidantes, podem contribuir para melhorar o desempenho reprodutivo de ovinos aumentando a viabilidade dos espermatozoides após o processo de criopreservação. Objetivou-se avaliar os efeitos dos antioxidantes (BC e AE) adicionados ao diluidor sobre a qualidade do sêmen de ovinos da raça Dorper após criopreservação. Foram utilizados seis carneiros da raça Dorper provenientes do Colégio Técnico de Teresina, Piauí, Brasil. O sêmen dos animais foi coletado uma vez por semana, durante 16 semanas. A coleta foi realizada com o auxílio de uma vagina artificial e uma fêmea em estro. As concentrações utilizadas neste estudo foram determinadas a partir da análise de viabilidade celular utilizando o teste de MTT. Foram formados os seguintes grupos experimentais: 1,0mM; 2,0mM e 3,0 mM de BC; e 0,5mM; 1,0mM; 2,0mM de AE, adicionados ao diluidor Tris-Gema. O diluidor Tris-Gema, sem adição das substâncias-teste, foi considerado como o grupo controle. O sêmen diluído foi envasado em palhetas e congelado em maquina TK 3000® e armazenadas em nitrogênio líquido. Após 15 dias de armazenamento, as amostras de sêmen foram descongeladas em banho-maria e foram feitos os testes in vitro. As amostras foram submetidas à análise espermática assistida por computador (Computer-assisted Sperm Analysis - CASA) para avaliar as características da cinética espermática pós-descongelação. A microscopia de epifluorescência foi utilizada para determinar a integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática e potencial de membrana mitocondrial. Foi utilizada a microscopia de contraste de fase para avaliar a motilidade total e o vigor espermático no teste de termorresistência (TTR). Também, foi realizado o teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) a fim de verificar a reação de peroxidação lipídica. Concluiu-se que o β-cariofileno não melhorou a qualidade dos espermatozoides de carneiro após a criopreservação, embora tenha melhorado o potencial mitocondrial, na concentração 1,0mM, e atenuado o estresse oxidativo, na concentração de 2,0mM. O ácido elágico não melhorou a qualidade dos espermatozoides de carneiro após a criopreservação, conquanto tenha atenuado o estresse peroxidativo, nas concentrações de 0,5 e 1,0mM de AE.

ABSTRACT: Semen cryopreservation offers great advantages for sheep breeding programs, promoting genetic gain. However, cryopreservation causes cryoinjuries and reduces sperm quality, mainly due to the excess production of reactive oxygen species (ROS) promoting a decrease in sperm motility observed after the thawing process. This is reflected in the low fertility rates of females inseminated with post-thawed semen when compared to fresh semen. However, this can be improved from advances in reproductive biotechnologies and, mainly, with improvements in semen preservation extenders. It is important research to evaluate the effects of new antioxidant substances to be added in conventional semen cryopreservation extenders, in order to protect sperm cells from this imbalance in the production of reactive oxygen species (ROS). It is assumed that β-caryophyllene (BC) and Ellagic acid (EA), both antioxidants, can contribute to improve the reproductive performance of sheep by increasing sperm viability after the cryopreservation process. The objective was to evaluate the effects of antioxidants (BC and AE) added to the extender on the semen quality of Dorper sheep after cryopreservation. Six Dorper rams from the Technical College of Teresina, Piauí, Brazil were used. The animals' semen was collected once a week for 16 weeks. The collection was performed with the aid of an artificial vagina and a female in estrus. The concentrations used in this study were determined from cell viability analysis using the MTT test. The following experimental groups were formed: 1.0mM; 2.0mM and 3.0mM BC; and 0.5mM; 1.0mM; 2.0mM of EA, added to the Tris-Gema extender. The Tris-Gema extender, without the addition of test substances, was considered as the control group. The diluted semen was packed in straws and frozen in a TK 3000® machine and stored in liquid nitrogen. After 15 days of storage, the semen samples were thawed in a water bath and the in vitro tests were performed. The samples were submitted to computer-assisted sperm analysis (CASA) to evaluate the characteristics of post-thawing sperm kinetics. Epifluorescence microscopy was used to determine acrosomal integrity, plasma membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Phase contrast microscopy was used to assess total motility and sperm vigor in the heat resistance test (TTR). Also, the test of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) was performed in order to verify the lipid peroxidation reaction. It was concluded that β-caryophyllene did not improve the quality of ram spermatozoa after cryopreservation, although it improved mitochondrial potential at a concentration of 1.0mM and attenuated oxidative stress at a concentration of 2.0mM. Ellagic acid did not improve ram sperm quality after cryopreservation, although it attenuated peroxidative stress at concentrations of 0.5 and 1.0 mM AE.