SEQUENCIAMENTO DO GENOMA DO COWPEA SEVERE MOSAIC VIRUS E CARACTERIZAÇÃO DE FATOR MOLECULAR POSSIVELMENTE ENVOLVIDO COM A RESISTÊNCIA DO FEIJÃO-CAUPI

Abstract

RESUMO: Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), causador do mosaico severo do feijãocaupi, é considerado fator limitante para a cultura. Dependendo da cultivar e da época de infecção, o CPSMV pode reduzir a produção em até 80%. A planta infectada pode apresentar sintomas de mosaico, bolhosidade e nanismo. Apesar da importância desse patógeno, não se tem conhecimento da sequência nucleotídica completa de isolados brasileiros de CPSMV. Além disso, embora existam cultivares de feijão-caupi resistentes ao CPSMV, não é conhecido o mecanismo de resistência envolvido. O presente trabalho teve como objetivos: (1) Obter o genoma completo de um isolado de CPSMV, e (2) caracterizar o fator de iniciação da tradução eIF4E de genótipos de feijão-caupi resistentes e suscetíveis ao CPSMV. Plantas de feijão-caupi var. Imponente foram inoculadas via extrato vegetal com o isolado CPSMV THE_18-01. Após 20 dias, o RNA total das plantas sintomáticas foi extraído e, posteriormente, sequenciado por meio da plataforma NovaSeq 6000. Foram obtidas sequências parciais do RNA 1 (98,0%) e RNA 2 (93,3%). As regiões 5’ e 3’ não traduzidas não foram completamente sequenciadas. O RNA 1 é composto de 5.577 nucleotídeos (nt), codificando uma poliproteína com 1858 aminoácidos (aa). O RNA 2 apresenta 3.005 nt, codificando uma poliproteína de 972 ou 1001 aa. O isolado CPSMV THE_18-01 apresentou baixa identidade de sequências de nt e aa da poliproteína e das proteínas codificadas, quando comparadas com as sequências do isolado de referência CPSMV DG (EUA). As poliproteínas do isolado THE_18-01 apresentaram 78% (nt) e 91% (aa) e 74% (nt) e 83% (aa) dos RNAs 1 e 2 respectivamente, em comparação às sequências do isolado de referência. A região mais variável entre os dois isolados foi aquela codificadora da MP, enquanto VPg foi o cístron que apresentou maior conservação de sequência. Oito plantas de cada genótipo de feijão-caupi (três resistentes e dois suscetíveis) foram inoculadas com CPSMV THE_18-01. Duas plantas de cada genótipo não foram inoculadas (testemunhas). Após 20 dias, o RNA total das folhas foi extraído, amplificadas por RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para o CPSMV e eIF4E, e sequenciadas. Por meio do quadro sintomatológico e da presença ou ausência de fragmento amplificado por RT-PCR, os genótipos foram confirmados como resistentes ou suscetíveis. Os padrões polimórficos do gene eIF4E foram averiguados e revelaram duas substituições não sinônimas, diferindo os genótipos resistentes dos suscetíveis. Uma localizou-se na região I (Pro76 ou Ala/Glu76), enquanto a outra fora das regiões I e II (Lys175/ Agr175), ambas as mutações podendo estar associadas a resistência do feijão-caupi ao CPSMV. Esses resultados poderão ser utilizados para subsidiar os programas de melhoramento de feijão-caupi na obtenção de genótipos resistentes, seja por transgenia ou melhoramento genético convencional. ABSTRACT: Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), which causes the severe cowpea mosaic, is considered a limiting factor for the crop. Depending on the cultivar and the time of infection, CPSMV can reduce production by up to 80%. The infected plant may show symptoms of mosaic, blistering and dwarfism. Despite the importance of this pathogen, the complete nucleotide sequence of Brazilian CPSMV isolates is unknown. In addition, although there are cowpea cultivars resistant to CPSMV, the resistance mechanism involved is unknown. The present work had as objectives: (1) To obtain the complete genome of a CPSMV isolate, and (2) to characterize the eIF4E translation initiation factor of resistant and susceptible cowpea genotypes to CPSMV. Cowpea plants var. Imponente were inoculated via plant extract with the isolate CPSMV THE_18-01. After 20 days, the total RNA of the symptomatic plants was extracted and subsequently sequenced using the NovaSeq 6000 platform. Partial sequences of RNA 1 (98.0%) and RNA 2 (93.3%) were obtained. The 5 'and 3' untranslated regions have not been completely sequenced. RNA 1 is composed of 5.577 nucleotides (nt), encoding a polyprotein with 1.858 amino acids (aa). RNA 2 has 3.005 nt, encoding a 972 or 1.001 aa polyprotein. The CPSMV isolate THE_18-01 showed low identity of nt and aa sequences of the polyprotein and encoded proteins, when compared to the sequences of the reference isolate CPSMV DG (USA). The polyproteins of THE_18- 01 isolate showed 78% (nt) and 91% (aa) and 74% (nt) and 83% (aa) of RNAs 1 and 2 respectively, compared to the sequences of the reference isolate. The most variable region between the two isolates was that encoding the MP, while VPg was the cistron that showed the highest sequence conservation. Eight plants of each cowpea genotype (three resistant and two susceptible) were inoculated with CPSMV THE_18- 01. Two plants of each genotype were not inoculated (controls). After 20 days, the total RNA of the leaves was extracted, amplified by RT-PCR with specific oligonucleotides for CPSMV and eIF4E, and sequenced. Through the symptoms and the presence or absence of a fragment amplified by RT-PCR, the genotypes were confirmed as resistant or susceptible. The polymorphic patterns of the eIF4E gene were investigated and revealed two non-synonymous substitutions, differing the resistant genotypes from the susceptible ones. One was located in region I (Pro76 or Ala / Glu76), while the other outside regions I and II (Lys175 / Agr175), both mutations may be associated with cowpea resistance to CPSMV. These results can be used to subsidize cowpea breeding programs in obtaining resistant genotypes, either by transgenics or conventional genetic improvement.