EFEITO DE DIFERENTES PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVAÇÃO SOBRE A VIABILIDADE DE FIBROBLASTOS DE BOVINOS DA RAÇA CURRALEIRO PÉ DURO

Abstract

RESUMO: Os bovinos da raça Curraleiro Pé Duro possuem grande rusticidade e capacidade de adaptação, o que despertou interesse em cruzamentos genéticos, contribuindo com a diminuição drástica do número de animais. A técnica de Criopreservação de Células Somáticas, permite estocar por tempo indeterminado o material genético. Objetivou-se com essa pesquisa avaliar a viabilidade de células somáticas, pós criopreservação em três protocolos. O experimento foi realizado no Laboratório de Biotecnologia em Reprodução Animal LBRA/CCA/UFPI, Teresina-PI. Utilizou-se um bovino da raça Curraleiro Pé Duro, saudável, alimentado a pasto com suplementação de ração, acesso a água e sal à vontade. Após os exames iniciais, ocorreram as etapas de assepsia, tricotomia, anestesia e colheita da biópsia do tecido auricular, que foi transportada dentro de uma caixa com temperatura controlada. A biópsias foram processadas e incubadas em atmosfera controlada, a 39°C, 5% de CO2 na atmosfera e umidade saturada. As células foram observadas quando a confluência e a morfologia até a quarta e quinta passagem e então, criopreservadas em 3 tratamentos, o primeiro (T1) utilizando um freezer a -20°C/24h e imersão em botijão com Nitrogênio Líquido, o segundo tratamento (T2) utilizando um freezer a -80°C/24h e imersão em botijão com Nitrogênio Líquido e o terceiro tratamento (T3) utilizando uma máquina com curva de criopreservação controlada, que após estabilização de - 6°C, decresceu -0,5°C/min até -32°C e então, após estabilizadas foram imersas no botijão criogênico. Após 10 dias foram descongeladas e analisadas quanto a sua viabilidade celular, pela técnica de Azul de Tripan, colocadas novamente em cultura e em 7 dias, analisadas quanto a confluência e morfologia novamente. Os dados passaram por análise de Variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey com significância de 5%. Não foram observadas nos protocolos de criopreservação, diferenças estatísticas entre a viabilidade celular (T1 = 68,00%, T2 = 72,14% e T3 = 70,99%), a capacidade de confluência (T1 = 80%, T2 = 90%, T3 = 85%) ou passagem de origem das células. A criopreservação de fibroblastos auriculares de bovinos Curraleiro Pé Duro, não teve diferença entre os três métodos de criopreservação, sugerindo até que o método que demanda equipamentos menos especializados (T1) é tão eficiente quanto os demais. Os protocolos se mostram uma ferramenta positiva para a conservação do material genético de raças nativas em risco de extinção, na forma de bancos de germoplasma, com grande potencial para utilização em biotécnicas de reprodução assistida. ABSTRACT: Bovine of the breed Curraleiro Pé Duro have great rusticity and adaptability, which aroused interest in genetic crossings, contributing to a drastic reduction in the number of animals. The Somatic Cell Cryopreservation technique allows the storage of genetic material indefinitely. The objective of this research was to evaluate the viability of somatic cells, post cryopreservation in three protocols. The experiment was carried out at the Laboratory of Biotechnology in Animal Reproduction LBRA/CCA/UFPI, Teresina-PI. A healthy cattle of the breed Curraleiro Pé Duro was used, fed on pasture with supplemental feed, access to water and salt at will. After the initial exams, there were the steps of asepsis, trichotomy, anesthesia and collection of the auricular tissue biopsy, which was transported inside a temperature-controlled box. Biopsies were processed and incubated in a controlled atmosphere, at 39°C, 5% CO2 in the atmosphere and saturated humidity. Cells were observed at confluence and morphology until the fourth and fifth passage and then cryopreserved in 3 treatments, the first (T1) using a freezer at -20°C/24h and immersion in a cylinder with Liquid Nitrogen, the second treatment (T2) using a freezer at -80°C/24h and immersion in a cylinder with Liquid Nitrogen and the third treatment (T3) using a machine with controlled cryopreservation curve, which after stabilization at -6°C, decreased by -0.5 °C/min to -32°C and then, after stabilized, they were immersed in the cryogenic cylinder. After 10 days they were thawed and analyzed for cell viability by the Trypan Blue technique, placed again in culture and after 7 days, analyzed for confluence and morphology again. The data underwent analysis of variance and means were compared using the Tukey test with a significance level of 5%. Statistical differences were not observed in the cryopreservation protocols between cell viability (T1 = 68.00%, T2 = 72.14% and T3 = 70.99%), and confluence capacity (T1 = 80%, T2 = 90 %, T3 = 85%) or cell origin passage. The cryopreservation of ear fibroblasts from bovine Curraleiro Pé Duro had no difference between the three cryopreservation methods, even suggesting that the method that requires less specialized equipment (T1) is as efficient as the others. The protocols are a positive tool for the conservation of genetic material from native breeds at risk of extinction, in the form of germplasm banks, with great potential for use in assisted reproduction biotechniques.