ENVOLVIMENTO DA ENZIMA ARGININOSUCCINATO SINTETASE NO EFEITO VASORRELAXANTE DO PEPTÍDEO BPP-BRACHYNH2 NA DISFUNÇÃO ENDOTELIAL INDUZIDA POR ENDOTOXINA

Abstract

RESUMO:O BPP-BrachyNH2, um oligopeptídeo rico em prolina identificado pela primeira vez na secreção cutânea do anfíbio Brachycephalus ephippium, apresenta potencial aplicação em estudos com ênfase no tratamento de doenças relacionadas a deficiência de NO, o presente estudo aborda o efeito vasorrelaxante do BPP-BrachyNH2 em preparações de artérias de resistência do leito mesentérico de ratos em modelo de disfunção endotelial induzida por lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli e investigar os mecanismos de ação envolvidos na produção de NO causada pelo BPP-BrachyNH2 através de abordagens in vitro e in silico. Segmentos de artérias foram montados em miógrafo do tipo Mulvany-Halpern para registros de tensão isométrica. Após normalização e teste de função endotelial, BPP-BrachyNH2 (10-9 - 10-5 M) foi cumulativamente adicionado sobre pré-contrações induzidas por noradrenalina (10- 6 - 10-5 M). BPP-BrachyNH2 apresentou efeito vasorrelaxante em preparações previamente incubadas com LPS (10 μg/mL) durante 5 horas. Não foi observado efeito vasorrelaxante na ausência de LPS. Os possíveis mecanismos envolvidos foram avaliados através da adição de indometacina (3×10-6 M), inibidor não seletivo da cicloxigenase; L-NNA (10-4 M), inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase; 1400W (10-5 M), inibidor seletivo da óxido nítrico sintase induzível; ODQ (3×10-6 M), inibidor da guanilil ciclase solúvel, e MDLA (1 mM), inibidor da argininosuccinato sintetase (AsS), conforme protocolo. Os resultados foram expressos como média±EPM, e foram analisados por ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni (p<0,05). O efeito vasorrelaxante induzido pelo BPP-BrachyNH2 em preparações pré- incubadas com LPS foi abolido na presença de L-NNA e ODQ, e significativamente atenuado na presença de 1400W e MDLA. A redução do efeito vasorrelaxante de BPP-BrachyNH2 em artérias de resistência na presença de L-NNA, 1400W e ODQ corrobora com estudos prévios, que sugerem o envolvimento da via de produção de NO. A atenuação significativa do efeito do BPP-BrachyNH2 na presença de MDLA, indica o envolvimento de um possível aumento nos níveis de L-arginina, substrato para síntese de NO, induzido pelo BPP-BrachyNH2 em modelo de disfunção endotelial induzida por LPS. Os cálculos de ancoramento e dinâmica molecular foram realizados com o programa Autodock 4.2 escolhendo-se o algoritmo genético lamarquiano (LGA) para a busca de geometrias otimizadas. A estrutura da enzima (AsS) e dos ligantes (L-citrulina e BPP-BrachyNH2) foram preparados com o programa AutoDock Tools 1.5.6. para simulações de ancoramento. Cada simulação de ancoramento LGA consistiu de 100 corridas independentes. O complexo AsS_BPP-BrachyNH2 apresentou melhores parâmetros de afinidade (energia de ligação, constante de inibição e quantidade de interações com aminoácidos) comparados com o complexo AsS_L-citrulina.ABSTRACT:BPP-BrachyNH2, a proline-rich oligopeptide identified for the first time in the amphibian cutaneous secretion Brachycephalus ephippium, has potential application in studies with emphasis on the treatment of diseases related to NO deficiency, the present study addresses the vasorelaxative effect of BPP-BrachyNH2 in preparations of rat mesenteric bed endurance arteries in a model of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) induced endothelial dysfunction and to investigate the mechanisms of action involved in the production of NO caused by BPP-BrachyNH2 through in vitro and in silico approaches. Segments of arteries were mounted on a Mulvany-Halpern type myograph for isometric voltage records. After normalization and endothelial function testing, BPP-BrachyNH2 (10-9 - 10-5 M) was cumulatively added on pre-contractions induced by noradrenaline (10-6 - 10-5 M). BPPBrachyNH2 presented vasorelaxing effect in preparations previously incubated with LPS (10 μg / mL) for 5 hours. No vasorelaxant effect was observed in the absence of LPS. The possible mechanisms involved were evaluated by the addition of indomethacin (3 x 10-6 M), nonselective cyclooxygenase inhibitor; L-NNA (10-4 M), non-selective inhibitor of nitric oxide synthase; 1400W (10-5 M), selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase; ODQ (3 x 10- 6 M), soluble guanylyl cyclase inhibitor, and MDLA (1 mM), argininosuccinate synthetase inhibitor (AsS), according to protocol. The results were expressed as mean ± SEM, and were analyzed by one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test (p <0.05). The vasopressin effect induced by BPP-BrachyNH2 in preparations pre-incubated with LPS was abolished in the presence of L-NNA and ODQ, and significantly attenuated in the presence of 1400W and MDLA. The reduction of the vasorelaxant effect of BPP-BrachyNH2 on resistance arteries in the presence of L-NNA, 1400W and ODQ corroborates previous studies that suggest the involvement of the NO production pathway. The significant attenuation of the effect of BPPBrachyNH2 on the presence of MDLA indicates the involvement of a possible increase in the levels of L-arginine, a substrate for NO synthesis, induced by BPP-BrachyNH2 in a model of LPS-induced endothelial dysfunction. The anchoring and molecular dynamics calculations were performed with the Autodock 4.2 program, choosing the Lamarque (LGA) genetic algorithm to search for optimized geometries. The structure of the enzyme (AsS) and ligands (L-citrulline and BPP-BrachyNH2) were prepared with the AutoDock Tools 1.5.6 program. for anchor simulations. Each LGA anchor simulation consisted of 100 independent runs. The AsS_BPP-BrachyNH2 complex showed better affinity parameters (binding energy, inhibition constant and amount of interactions with amino acids) compared to the AsS_L-citrulline complex.