Abstract:
RESUMO:O BPP-BrachyNH2, um oligopeptídeo rico em prolina identificado pela primeira vez na
secreção cutânea do anfíbio Brachycephalus ephippium, apresenta potencial aplicação em
estudos com ênfase no tratamento de doenças relacionadas a deficiência de NO, o presente
estudo aborda o efeito vasorrelaxante do BPP-BrachyNH2 em preparações de artérias de
resistência do leito mesentérico de ratos em modelo de disfunção endotelial induzida por
lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli e investigar os mecanismos de ação envolvidos na
produção de NO causada pelo BPP-BrachyNH2 através de abordagens in vitro e in silico.
Segmentos de artérias foram montados em miógrafo do tipo Mulvany-Halpern para registros
de tensão isométrica. Após normalização e teste de função endotelial, BPP-BrachyNH2 (10-9 -
10-5 M) foi cumulativamente adicionado sobre pré-contrações induzidas por noradrenalina (10-
6
- 10-5 M). BPP-BrachyNH2 apresentou efeito vasorrelaxante em preparações previamente
incubadas com LPS (10 μg/mL) durante 5 horas. Não foi observado efeito vasorrelaxante na
ausência de LPS. Os possíveis mecanismos envolvidos foram avaliados através da adição de
indometacina (3×10-6 M), inibidor não seletivo da cicloxigenase; L-NNA (10-4 M), inibidor não
seletivo da óxido nítrico sintase; 1400W (10-5 M), inibidor seletivo da óxido nítrico sintase
induzível; ODQ (3×10-6 M), inibidor da guanilil ciclase solúvel, e MDLA (1 mM), inibidor da
argininosuccinato sintetase (AsS), conforme protocolo. Os resultados foram expressos como
média±EPM, e foram analisados por ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni
(p<0,05). O efeito vasorrelaxante induzido pelo BPP-BrachyNH2 em preparações pré-
incubadas com LPS foi abolido na presença de L-NNA e ODQ, e significativamente atenuado
na presença de 1400W e MDLA. A redução do efeito vasorrelaxante de BPP-BrachyNH2 em
artérias de resistência na presença de L-NNA, 1400W e ODQ corrobora com estudos prévios,
que sugerem o envolvimento da via de produção de NO. A atenuação significativa do efeito do
BPP-BrachyNH2 na presença de MDLA, indica o envolvimento de um possível aumento nos
níveis de L-arginina, substrato para síntese de NO, induzido pelo BPP-BrachyNH2 em modelo
de disfunção endotelial induzida por LPS. Os cálculos de ancoramento e dinâmica molecular
foram realizados com o programa Autodock 4.2 escolhendo-se o algoritmo genético
lamarquiano (LGA) para a busca de geometrias otimizadas. A estrutura da enzima (AsS) e dos
ligantes (L-citrulina e BPP-BrachyNH2) foram preparados com o programa AutoDock Tools
1.5.6. para simulações de ancoramento. Cada simulação de ancoramento LGA consistiu de 100
corridas independentes. O complexo AsS_BPP-BrachyNH2 apresentou melhores parâmetros de
afinidade (energia de ligação, constante de inibição e quantidade de interações com
aminoácidos) comparados com o complexo AsS_L-citrulina.ABSTRACT:BPP-BrachyNH2, a proline-rich oligopeptide identified for the first time in the amphibian
cutaneous secretion Brachycephalus ephippium, has potential application in studies with
emphasis on the treatment of diseases related to NO deficiency, the present study addresses the
vasorelaxative effect of BPP-BrachyNH2 in preparations of rat mesenteric bed endurance
arteries in a model of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) induced endothelial
dysfunction and to investigate the mechanisms of action involved in the production of NO
caused by BPP-BrachyNH2 through in vitro and in silico approaches. Segments of arteries were
mounted on a Mulvany-Halpern type myograph for isometric voltage records. After
normalization and endothelial function testing, BPP-BrachyNH2 (10-9 - 10-5 M) was
cumulatively added on pre-contractions induced by noradrenaline (10-6 - 10-5 M). BPPBrachyNH2 presented vasorelaxing effect in preparations previously incubated with LPS (10
μg / mL) for 5 hours. No vasorelaxant effect was observed in the absence of LPS. The possible
mechanisms involved were evaluated by the addition of indomethacin (3 x 10-6 M), nonselective cyclooxygenase inhibitor; L-NNA (10-4 M), non-selective inhibitor of nitric oxide
synthase; 1400W (10-5 M), selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase; ODQ (3 x 10-
6 M), soluble guanylyl cyclase inhibitor, and MDLA (1 mM), argininosuccinate synthetase
inhibitor (AsS), according to protocol. The results were expressed as mean ± SEM, and were
analyzed by one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test (p <0.05). The vasopressin
effect induced by BPP-BrachyNH2 in preparations pre-incubated with LPS was abolished in
the presence of L-NNA and ODQ, and significantly attenuated in the presence of 1400W and
MDLA. The reduction of the vasorelaxant effect of BPP-BrachyNH2 on resistance arteries in
the presence of L-NNA, 1400W and ODQ corroborates previous studies that suggest the
involvement of the NO production pathway. The significant attenuation of the effect of BPPBrachyNH2 on the presence of MDLA indicates the involvement of a possible increase in the
levels of L-arginine, a substrate for NO synthesis, induced by BPP-BrachyNH2 in a model of
LPS-induced endothelial dysfunction. The anchoring and molecular dynamics calculations
were performed with the Autodock 4.2 program, choosing the Lamarque (LGA) genetic
algorithm to search for optimized geometries. The structure of the enzyme (AsS) and ligands
(L-citrulline and BPP-BrachyNH2) were prepared with the AutoDock Tools 1.5.6 program. for
anchor simulations. Each LGA anchor simulation consisted of 100 independent runs. The
AsS_BPP-BrachyNH2 complex showed better affinity parameters (binding energy, inhibition
constant and amount of interactions with amino acids) compared to the AsS_L-citrulline
complex.
Description:
Orientador :Prof. Dr. Daniel Dias Rufino Arcanjo.Examinador Externo:Prof.ª Dra. Alexandra Patrícia Rego Plácido do Nascimento (Universidade do Porto). Examinador Externo:Prof. Dr. José Roberto de Souza de Almeida Leite (Universidade de Brasília). Examinador Interno :Prof. Dr. João Paulo Jacob Sabino