CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE COMUNIDADE BACTERIANA SIMBIONTE E ENDOFÍTICA PRESENTES EM NÓDULOS DE FEIJÃO-FAVA

Abstract

RESUMO As bactérias capazes de estabelecer simbiose com leguminosas a partir da formação de nódulos em suas raízes e/ou caules são genericamente chamadas de rizóbios ou simbiontes. Anteriormente, acreditava-se que todas as bactérias que habitavam o interior desses nódulos tinham capacidade de induzir sua formação e de fixar nitrogênio atmosférico. No entanto, estudos mostram que a comunidade bacteriana presente em nódulos de muitas leguminosas é formada não somente por rizóbios, mas também por bactérias endofíticas que não possuam as habilidades citadas a cima. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi descrever a diversidade da comunidade bacteriana associada aos nódulos radiculares de feijão-fava (P. lunatus L.) a partir de uma abordagem polifásica, por meio da caracterização morfofisiológica, da análise de fragmentos rep(BOX)-PCR e do sequenciamento parcial dos genes 16S rRNA, glnII e gyrB. Os 36 isolados foram obtidos em amostras de solos dos distritos de Nova Esperança (07º77’10”S E 93º51’58”W) e Santa Rita (07º71’49”S E 93º60’08”W), pertencentes ao município de Água Branca-PI, classificados como Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico, utilizando feijão-fava como planta isca. A extração do DNA foi realizada utilizando kit comercial, conforme recomendação do fabricante, após cultivo dos isolados em meio YM líquido em agitador orbital. Destes isolados, 34 foram submetidos a uma caracterização bioquímica, 29 a uma análise rep(BOX)-PCR, 32 a uma amplificação do gene 16S rRNA, 14, do gene glnII e 15, do gene gyrB. Uma matriz binária foi construída a partir das características fenotípicas avaliadas e os isolados foram agrupados baseados no algoritmo UPGMA e coeficiente de Jaccard. As análises dos fragmentos BOX foram realizadas no programa Bionumercs versão 7.5, utilizando o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard. A análise das sequências dos genes 16S rRNA, glnII e gyrB foi realizada a partir do programa Phred. O alinhamento foi realizado usando MEGA softwere versão 6.0 com os parâmetros padrão, o modelo de distância K2P e algoritmo Neighbour-Joining. Tanto o dendrograma fenotípico quanto a árvore filogética gerada a partir de perfis rep(BOX)-PCR mostraram grande diversidade entre os isolados, os quais agruparam-se a um baixo nível de similaridade. Foram detectados representantes dos gêneros Bradyrhizobium; Rhizobium e Burkholderia, os quais possuem espécies de rizóbios, assim como representantes de gêneros de bactérias endofíticas tais como Pseudomas, Enterobacter Williamsia, Enterobacteriaceae, Agrobacterium, Bacillus, Paenobacillus e Serratia, relatados pela primeira vez em P. lunatus. A preferência desta leguminosa por associar-se Bradyrhizobium foi confirmada. No entanto, uma grande diversidade de bactérias simbiontes e endofíticas também foram contatadas em seus nódulos. Além disso, os isolados UFPI-F16, UFPI-F06, UFPI-F03, UFPI-F15, UFPI-F17 e UFPI-F19 são apontados como prováveis novas espécies. ABSTRACT Bacteria capable of establishing symbiosis with legumes from the formation of nodules in their roots and / or stems are generically called rhizobia or symbionts. Previously, it was believed that all the bacteria that inhabited the interior of these nodules had the capacity to induce their formation and to fix atmospheric nitrogen. However, studies show that the bacterial community present in nodules of many legumes is formed not only by rhizobia, but also by endophytic bacteria that do not have the above mentioned abilities. The objective of the present work was to describe the diversity of the bacterial community associated with root bean (P. lunatus L.) nodules from a polyphasic approach by means of the morphophysiological characterization of rep fragments analysis (BOX ) -PCR and the partial sequencing of the 16S rRNA, glnII and gyrB genes. The 36 isolates were obtained from samples of soils of the Nova Esperança districts (07º77'10 "SE 93º51'58" W) and Santa Rita (07º71'49 "SE 93º60'08" W), belonging to the municipality of Água Branca-PI , classified as Red-Yellow Dystrophic Latosol, using fava beans as bait plants. DNA extraction was performed using commercial kit, as recommended by the manufacturer, after culturing the isolates in liquid YM medium on orbital shaker. From these isolates, 34 were submitted to a biochemical characterization, 29 to a rep (BOX) -PCR analysis, 32 to an amplification of the gene 16S rRNA, 14, of the glnII gene and 15, of the gyrB gene. A binary matrix was constructed from the phenotypic characteristics evaluated and the isolates were grouped based on the UPGMA algorithm and Jaccard coefficient. The analyzes of the BOX fragments were performed in the Bionumercs program version 7.5, using the UPGMA algorithm and the Jaccard coefficient. Sequence analysis of the 16S rRNA, glnII and gyrB genes was performed from the Phred program. Alignment was performed using MEGA softwere version 6.0 with the default parameters, the K2P distance model and the Neighbor-Joining algorithm. Both the phenotypic dendrogram and the phylogenetic tree generated from rep (BOX) -PCR profiles showed great diversity among the isolates, which were grouped at a low level of similarity. Representatives of the genus Bradyrhizobium were detected; Rhizobium and Burkholderia, which have species of rhizobia, as well as representatives of endophytic bacteria genera such as Pseudomas, Enterobacter Williamsia, Enterobacteriaceae, Agrobacterium, Bacillus, Paenobacillus and Serratia, reported for the first time in P. lunatus. The preference of this legume for associating Bradyrhizobium was confirmed. However, a great diversity of symbiotic and endophytic bacteria were also contacted in their nodules. In addition, the isolates UFPI-F16, UFPI-F06, UFPI-F03, UFPI-F15, UFPI-F17 and UFPI-F19 are identified as probable new species.