INVESTIGAÇÃO DO EFEITO VASORRELAXANTE DO NEROL EM AORTA ISOLADA DE RATO

Abstract

RESUMO: No presente estudo investigou-se o efeito vasorrelaxante do nerol em anéis de artéria aorta isolada de rato. Foram usados Ratus novergicus (250-300 g), oriundos do Biotério do NPPM/UFPI, mantidos em temperatura de 24 ± 1°C e ciclo claro-escuro de 12 horas, com livre acesso a água e ração. Os protocolos (n=5-6/protocolo) foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação com Animais (CEEA/UFPI 008/2012). Os ratos foram anestesiados e após eutanásia a aorta foi retirada e os anéis (2-3 mm) foram suspensos por alças de aço inoxidável, em cubas de vidros de 6 mL contendo solução de Krebs Normal (pH 7,4), aerada com carbogênio (95% de O2 e 5% de CO2), mantidos a 37ºC, e fixados individualmente por linhas de algodão a um transdutor de força acoplado a um sistema de aquisição (AECAD/AQCAD/AVS Projetos, SP/Brasil) para o registro das tensões isométricas. Após estabilização de 60 minutos sob tensão de 1 gf, verificou-se a presença ou ausência do endotélio vascular nos anéis de aorta por adição de acetilcolina (ACh, 1 μM) sobre o componente tônico da contração gerada pela adição de fenilefrina (FEN, 1 μM). Anéis com relaxamento maior que 50%, eram considerados com endotélio (E+) e anéis com relaxamento menor que 10%, sem endotélio funcional (E-). Durante a fase tônica de uma segunda contração induzida por FEN ou 80 mM de KCl, em preparações diferentes, com e sem endotélio funcional, nerol (0,1-750 μg/mL), foi adicionado às cubas cumulativamente. Anéis sem endotélio foram contraídos com concentrações cumulativas de KCl (10-100 mM), e a inibição da contração avaliada na presença de concentrações individuais de nerol (9, 27,81, 243 e 750 μg/mL). Em outro momento, anéis sem endotélio foram pré-incubados com 5 mM de KCl e contraídos com Bay K8644 (10-7 M), um ativador de canais de Ca2+ do tipo L (CaV- L) e na fase tônica da contração administrou-se nerol de maneira cumulativa. A potência vasorelaxante do nerol foi avaliada através da comparação dos valores de pD2 e Emáx obtidos nas preparações individuais. Para avaliar a participação da proteína cinase C (PKC) na resposta vasorelaxante do nerol, anéis de aorta sem endotélio foram pré- incubados com bisindolilmaleimida I (BIS-1, 10-7 M), durante 20 minutos e contraídos com FEN. Na fase tônica da contração, nerol foi adicionado cumulativamente à cuba. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para comparação entre as medias, foi usado o Teste t de student não pareado, com significância para valores de *p<0.05. Valores de pD2 foram obtidos por regressão não linear (GraphPad Prism®). Os resultados mostram que nerol foi capaz de relaxar os anéis de aorta pré-contraidos com FEN dependente de concentração e equipotentes quando na presença (E+: pD2 = 1,78 ± 0,02) e na ausência do endotélio (E-: pD2 = 1,74 ± 0,07). Nerol também promoveu efeito vasorelaxante dependente de concentração em anéis de aorta contraídos com 80 mM (E-: pD2 = 1,46 ± 0,01), sem diferença estatística comparado com FEN sugerindo que o mesmo age pela mesma via de sinalização dos dois agentes contráteis. Nerol inibiu de maneira significativa a contração em anéis de aorta pela adição cumulativa de KCl, reduzindo o efeito máximo nas concentrações de 27 μg/mL: Emáx (%) = 59,9 ± 10,3*; 243 μg/mL, Emáx (%)=11,8 ± 2,60*; 750 μg/mL: Emáx (%)=6,0±3,28*, comparados ao controle: Emax (%) = 91,8±8,16 μg/mL. Na presença do inibidor da PKC, nerol não foi diferente do controle. Conclui-se que nerol apresenta efeito relaxante dependente de concentração e independente do endotélio vascular em anéis de aorta, e esse efeito é sugestivo de bloqueio do influxo de Ca2+ pelos CaV-L, e independe da PKC. ABSTRACT: In the present study we investigated the vasorelaxant effect of nerol in isolated rat aorta rings. Male rats (250-300 g) were used, obtained from Vivarium the NPPM/ UFPI, kept at a temperature of 24 ± 1 °C and light-dark cycle of 12 hours, with free access to food and water. Protocols (n = 5-6 / protocol) were approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation (CEEA/UFPI nº 008/2012). Rats were anesthetized and euthanized after the aorta was removed and the rings (3-4 mm) were suspended by strips of stainless steel vat for isolated organ bath containing 6 mL of Normal Krebs solution (pH 7.4), aerated with carbogen (95% O2 and 5% CO2) and maintained at 37 °C, and individually set by cotton thread to a force transducer coupled to an acquisition system (AECAD/AQCAD/AVS Projects, SP/Brazil) for recording isometric tensions. After stabilization for 60 minutes with 1 gf, it was verified the presence or absence of vascular endothelium in aortic rings by addition of acetylcholine (ACh, 1 μM) on the tonic component of the contraction induced by the addition of phenylephrine (PHE, 1μM). Rings with greater than 50% relaxation, the endothelium was considered (E+) and rings with less than 10%, no functional endothelium (E-) relaxation. During the tonic phase of a second PHE induced by 80 mM KCl or in different preparations with and without functional endothelium, nerol (0.1 to 750 μg/mL), contraction was cumulatively added to the wells. Ring without endothelium were contracted with cumulative concentrations of KCl (10-100 mM), and inhibition of the contraction measured in the presence of individual concentrations of nerol (9, 27, 81, 243 and 750 μg/mL). At another point, rings without endothelium were pre-incubated with 5 mM KCl and contracted with Bay K8644 (10-7 M), an activator of L-type Ca2+ (CaV-L) channels and tonic phase of contraction was administered nerol cumulatively. The vasorelaxant potency of nerol was assessed by comparison of pD2 and Emax values obtained in the individual preparations. To evaluate the role of protein kinase C (PKC) on the vasorelaxant response nerol, aortic rings without endothelium were pre-incubated with bisindolylmaleimide 1 (10-7 M) for 20 minutes and contracted with PHE. In the tonic phase of contraction, nerol was cumulatively added to the bath. Results were expressed as mean ± SEM. For comparison between the media, we used the t test for unpaired student, with significance for values of *p<0.05. pD2 values were obtained by non-linear regression (GraphPad Prism ®). The results show that nerol was able to relax the aortic rings precontracted with PHE-dependent and equipotent concentration in the presence (E+: pD2 = 1.78 ± 0.02) and in the absence of the endothelium (E-: pD2 = 1.74 ± 0.07). Nerol also promoted a concentration-dependent vasorelaxant effect in aortic rings contracted with 80 mM (E-: pD2 = 1:46 ± 0:01), no statistical difference compared with PHE suggesting that it acts in the same signaling pathway of both contractile agents. Nerol inhibited significantly the contraction in aortic rings by cumulative addition of KCl, reducing the maximum effect at concentrations of 27 μg/mL: Emax (%) = 59.9 ± 10.3 *; 243 μg/mL, Emax (%) = 11.8 ± 2.60 *; 750 mg/mL: Emax (%) = 6.0 ± 3:28 *, compared to the control: Emax (%) = 91.8 ± 8.16 μg/mL. In the presence of the PKC inhibitor, nerol was not different from control. It follows that nerol has a concentration-dependent relaxing effect and independent of vascular endothelium in aortic rings, and this effect is suggestive of blocking Ca2+ influx by CaV-L, and is independent of PKC.