PROTEÍNA CINASE ATIVADA POR AMP (AMPK) E OS MEDIADORES GASOSOS (H2S, NO E CO): evidência de interação mútua na gastroproteção em camundongos

Abstract

RESUMO: O sulfeto de hidrogênio (H2S), óxido nítrico (NO) e o monóxido de carbono (CO) constituem um grupo de mediadores gasosos biologicamente ativos que possuem efeito gastroprotetor por modulação positiva de fatores protetores da mucosa gástrica. Estudos demonstraram que esses mediadores gasosos exercem suas atividades biológicas interagindo com a Proteína Cinase Ativada por AMP (AMPK) em diferentes tipos de células. Entretanto, o envolvimento da AMPK no efeito gastroprotetor desses mediadores gasosos não é conhecido. OBJETIVOS: No presente estudo, buscamos elucidar se a AMPK previne e tem papel chave na proteção gástrica do H2S, NO e CO contra a lesão induzida por etanol. MÉTODO: camundongos Swiss foram pré-tratados com AICAR (20 mg/kg, um ativador da AMPK) sozinho ou com etanol 50%. Outros grupos foram pré-tratados com PAG (50 mg/kg, v.o, um inibidor de H2S), L-NAME (10 mg/Kg, i.p, um inibidor de NO) ou ZnPP IX (3 mg/Kg, i.p, um inibidor de CO) 30 minutos antes do AICAR. Em outro protocolo experimental, os animais foram pré-tratados com NaHS (150 μmol/kg, v.o), reagente de Lawesson (27 μmol/kg, v.o), NPS (10 mg/Kg, v.o), L-Arginina (200 mg/Kg, i.p), Hemina (10 mg/kg, i.p) ou CORM-2 (5 mg/kg, v.o) 30 minutos antes do etanol com ou sem o composto C (10 mg/kg, um inibidor não seletivo da AMPK). Os níveis de H2S, nitrato / nitrito (NO3-/NO2-) e bilirrubina foram avaliados nos homogenatos gástricos. A mucosa gástrica também foi coletada para análise histopatológica e para expressão da AMPK por imunohistoquímica. RESULTADOS: O pré-tratamento com AICAR atenuou a lesão gástrica (2,74 ± 1,23 mm2) quando comparado com o grupo etanol (43,89 ± 4,36 mm2) e aumentou os níveis de H2S (0,116 ± 0,009 μmol/g) e bilirrubina (0,0111 ± 0,0007 mg/dl), mas não os níveis de NO3-/NO2- na mucosa gástrica. Além disso, a inibição da síntese de H2S, NO ou de CO exacerbou o dano gástrico induzido por etanol e inibiu a gastroproteção do AICAR (50,83 ± 6,16 mm2, 33,77 ± 5,11 mm2, 47,30 ± 6,06 mm2, respectivamente). O pré-tratamento com o composto C reverteu o efeito gastroprotetor do NaHS (22,75 ± 3,27 mm2), reagente de Lawesson (48,25 ± 1,21 mm2), NPS (40,55 ± 5,16 mm2), L-arginina (33,85 ± 6,90 mm2), CORM-2 (53,64 ± 4,68 mm2) ou Hemina (40,66 ± 4,79 mm2). O composto C também reverteu o efeito do NaHS nos níveis de H2S (0,14 ± 0,03 μmol/g), do NPS nos níveis de NO3-/NO2- (0,62± 0,09 μM) e da Hemina nos níveis de bilirrubina ( 0,006 ± 0,004 mg/dl), quando comparados com os grupos tratados com NaHS, NPS ou Hemina (0,45 ± 0,06 μmol/g; 85 ± 0,02 μM; 0,0020 ± 0,002 mg/dl, respectivamente). A imunohistoquímica demonstrou que a AMPK está expressa em níveis basais principalmente nas células da mucosa gástrica e teve expressão aumentada pelo pré-tratamento com NaHS, NPS e CORM-2. CONCLUSÕES: A ativação da AMPK protege o tecido gástrico de camundongos contra a lesão induzida por etanol e interage mutuamente com o H2S, NO ou CO na gastroproteção. ABSTRACT: Hydrogen sulfide (H2S), nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO) are a group of biologically active gas mediators that have a gastroprotective effect by modulating positive defensive factors of the gastric mucosa. Studies have shown that these gaseous mediators exert their biological activities interacting with AMP-Activated Protein Kinase (AMPK) in different cell types. However, the involvement of AMPK in the gastroprotective effect of these gaseous mediators has not been reported yet. AIM: The aim of the present study was to evaluate whether 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) prevents and has key role in the gastricprotection of hydrogen sulfide (H2S), nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO) against ethanol-induced injury. METHOD: Mice were pretreated with AICAR (20 mg/kg, an AMPK activator) alone or with 50% ethanol. Other groups were pretreated with PAG (50 mg/kg, P.O, a H2S inhibitor), L-NAME (10 mg/Kg, i.p, a NO inhibitor) or ZnPP IX (3 mg/Kg, i.p, a CO inhibitor) 30 min prior of AICAR. In other design, the animals were pretreated with NaHS (150 μmol/kg, p.o), Lawesson’s reagent (27 μmol/kg, p.o), SNP (10 mg/Kg, p.o), L-Arginine (200 mg/Kg, i.p), Hemin (10 mg/kg, i.p) or CORM-2 (5 mg/kg, p.o) 30 min prior to ethanol with or without compound C (10 mg/kg, a non-selective AMPK inhibitor). The H2S, nitrate/nitrite (NO3-/NO2-) and bilirubin levels were evaluated in the gastric mucosa. The gastric mucosa also was collected to histopathological analysis and AMPK expression by immunohistochemistry. RESULTS: Pretreatment with AICAR (2,74 ± 1,23 mm2) attenuated the ethanol-induced injury and increased the H2S (0,116 ± 0,009 μmol/g) and bilirubin (0,0111 ± 0,0007 mg/dl) levels, but not NO3-/NO2- levels in the gastric mucosa. In addition, inhibition of the H2S, NO, or CO synthesis exacerbated the ethanol-induced gastric damage and inhibited the gastroprotection by AICAR (50,83 ± 6,16 mm2, 33,77 ± 5,11 mm2, 47,30 ± 6,06 mm2, respectively). Pretreatment with compound C reversed the gastroprotective effect of NaHS (22,75 ± 3,27 mm2), Lawesson’s reagent (48,25 ± 1,21 mm2), SNP (40,55 ± 5,16 mm2), L-Arginine (33,85 ± 6,90 mm2), CORM-2 (53,64 ± 4,68 mm2) or Hemin (40,66 ± 4,79 mm2). Compound C also reversed the effect of NaHS on H2S levels (0,14 ± 0,03 μmol/g) , SNP on NO3-/NO2- levels (0,62± 0,09 μM) and Hemin on bilirubin levels (0,006 ± 0,004 mg/dl) when compared with the NaHS, SNP or Hemina groups (0.45 ± 0.06 μmol/g, 85 ± 0.02 μM, 0.0020 ± 0.002 mg/dl, respectively). The immunohistochemistry revealed that AMPK occurs at basal levels mainly in the gastric mucosa cells, and was increased by pretreatment with NaHS, SNP and CORM-2. CONCLUSIONS: AMPK activation exerts gastroprotection against ethanol-induced gastric damage and mutually interacts with H2S, NO, or CO in the gastroprotection.