EFEITO DO EXTRATO E FRAÇÕES DE Zanthoxylum rhoifolium Lam. E DA RESINA DE Protium heptaphyllum (Aubl.) March. SOBRE A INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS POR Leishmania amazonensis.

Abstract

RESUMO: As leishmanioses são um conjunto de doenças parasitárias causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, afetando cerca de dois milhões de pessoas a cada ano e portanto classificadas como um problema de saúde pública. A descoberta de novas substâncias com promissor potencial leishmanicida e reduzida ação tóxica contra células de mamíferos tem fundamental importância para o controle e prevenção da leishmaniose. Sabendo que derivados vegetais estão entre as novas possibilidades para a obtenção de compostos bioativos, objetivou-se avaliar as atividades anti-leishmania, citotóxica e o efeito do extrato bruto etanólico (EEtOH) e frações acetato de etila (F. AcoEt), aquosa (F. AQ) e hexânica (F. HEX) obtidas da casca do caule de Zanthoxylum rhoifolium Lam. e da resina de Protium heptaphyllum March (R. ALM) sobre a infectividade in vitro de macrófagos murinos por Leishmania amazonensis. Para tanto, formas promastigotas metacíclicas foram incubadas na presença dos extratos nas concentrações de 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6,25 e 3,125 μg/mL em triplicatas, após 24, 48 e 72h os parasitas foram contados em câmara de Neubauer e a concentração inibitória média (IC50) calculada. A concentração citotóxica média (CC50) foi mensurada pelo tratamento de macrófagos com os extratos nas concentrações descritas, posterior incubação com MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-zil]-2,5-difeniltetrazólio) e leitura por absorbância em 550 nm do formazan produzido pela redução do MTT. A investigação de parâmetros de resposta à ativação de macrófagos como a variação do volume lisossomal e a capacidade fagocítica frente os tratamentos foi realizada utilizando-se o corante vermelho neutro e partículas de zimosan coradas. Avaliou-se ainda o estimulo à produção de óxido nítrico pela dosagem de nitrito e a influência do pré-tratamento de macrófagos ou de formas promastigotas sobre a infecção por leishmanias. Verificou-se que o extrato, frações e resina ocasionaram notável inibição dose e tempo dependente no desenvolvimento de formas promastigotas de Leishmania amazonensis, com valores de CI50 em 72h de 9,57; 10,21; 11,06; 7,96 e 6,18 μg/mL para EEtOH, F. AcoEt, F. AQ, F. HEX e R. ALM respectivamente. Os valores de CC50 obtidos para macrófagos foram maiores que 100 μg/mL para EEtOH, F. AcoEt, F. AQ e F. HEX, e de 53,99 μg/mL para R. ALM superando, portanto os valores de CI50 para promastigotas. O extrato, frações e resina estimularam a atividade fagocítica e a produção de nitrito, sem portanto incrementar o volume lisossomal. O pré tratamento de macrófagos ou formas promastigotas revelou expressiva queda, tanto no percentual de infecção, quanto no número de amastigotas por macrófago de forma concentração dependente. Conclui-se portanto que o extrato, frações e resina apresentam significativa ação anti-leishmania e propriedades na redução da infectividade de macrófagos in vitro...............................ABSTRACT: The leishmaniases are a group of diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania, which affects about two million people each year and therefore classified as a public health problem. The discovery of new substances with promising leishmanicidal potential and reduced toxic action against mammalian cells has fundamental importance for the control and prevention of leishmaniases. Knowing that derived from plants are among the possibilities for obtaining of bioactive compounds, aimed to evaluate anti-leishmania activity, cytotoxic and the effect of crude ethanol extract (EEtOH), ethyl acetate (F. AcoEt), aqueous (F. AQ) and hexanic (F. HEX) fractions from stem bark of Zanthoxylum rhoifolium Lam and resin of Protium heptaphyllum March (R. ALM) on the infectivity of murine macrophages in vitro by Leishmania amazonensis. For this metacyclic promastigotes forms were incubated in the presence of extract and its fractions in the concentrations of 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 and 3.125 μg/mL in triplicates, after 24, 48 and 72 h parasites were counted in the Chamber of Neubauer and mean inhibitory concentration (IC50) calculated. The mean cytotoxic concentration (CC50) was measured by treatment of macrophages with extract in concentrations already described, later incubation with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) and by reading absorbance at 550 nm of the formazan produced by reduction of MTT. The investigation of parameters of response to activation of macrophages as the volume change of lysosomal and phagocytic ability front of the treatments was performed using neutral red dye and zymosan particles stained. We also evaluated the stimulation of nitric oxide production by measuring nitrite and the influence of pretreatment of macrophages or promastigotes of Leishmania infection. It was found that the extract, fractions and resin caused remarkable inhibition dose and time dependent on the development of promastigotes of Leishmania amazonensis, with IC50 values in 72 h, 9.57, 10.21, 11.06, 7.96 and 6.18 μg/mL for EEtOH, F. AcoEt, F. AQ, F. HEX e R. ALM respectively. The values obtained for CC50 macrophages were all greater than 100 μg/mL, to EEtOH, F. AcoEt, F. AQ e F. HEX and 53.99 μg/mL to R. ALM overcoming so the IC50 values for promastigotes. The extract, fractions and resin stimulated phagocytic activity and nitrite production, without increasing the volume lysosomal. The pretreatment of macrophages or promastigotes revealed a significant decrease in the percentage of infection and number of amastigotes per macrophage in a dose dependent. It is concluded that the extract, fractions and resin have significant anti-leishmania action and properties in reducing the infectivity of macrophages in vitro.