ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE FRAÇÕES PROTEICAS DE SEMENTES DE Crotalaria retusa.

Abstract

RESUMO: As plantas são fontes importantes de compostos com ações farmacológicas. Estudos relatam que proteínas advindas de sementes podem ter ações terapêuticas relevantes como, antifúngica, antimicrobiana, anti-inflamatória, antinociceptiva e anticancerígena. Diante deste potencial, o presente estudo teve como objetivo avaliar as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva de frações proteicas obtidas a partir de sementes de Crotalaria retusa. As sementes de C. retusa foram coletadas na cidade de Parnaíba-PI e trituradas para formação de uma farinha de fina granulação, ao qual foi submetida a fracionamento segundo o método de Osborne. Eletroforese SDS-PAGE foi realizada para caracterização do perfil proteico das frações Albumina (Alb) e Globulina (Glb). Foi conduzido o teste de hemaglutinação para investigação da presença de lectinas. Foi utilizada cromatografia por afinidade em coluna de guar gum na tentativa de purificação de lectina presente nas frações. A atividade anti-inflamatória das frações foram avaliadas pelos métodos de edema de pata (induzido por carragenina e dextrana), quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) e peritonite induzida por carragenina. A atividade antinociceptiva foi avaliada por testes de estímulo químico (contorções abdominais induzidas por ácido acético e formalina). Camundongos Swiss fêmeas (Mus musculus) pesando entre 25 – 28g (n = 6) foram utilizados na realização de todos os ensaios. Estes seguiram as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e os resultados expressos como média ± erro padrão (ANOVA - Newman-Kleus; p < 0,05). A análise do perfil eletroforético mostrou que as frações Alb e Glb possuem pelos menos quatro bandas com peso molecular entre 21,1 a 64,0 Kda. Os resultados mostram que as frações Alb e Glb (5, 10 e 20mg/kg) administradas por via intraperitoneal (i.p.) foram capazes de reduzir a formação do edema de pata induzido por carragenina a partir da 2ª h do ensaio, sendo a dose de 20mg/kg de ambas com o melhor percentual de redução do edema a partir da 3ª e 4ª h, indicando que elas possam atuar inibindo a migração leucocitária. Fato este corroborado e reforçado com os dados da quantificação da enzima MPO e peritonite. A dose de 20mg/kg (Alb e Glb) reduziu significativamente a quantificação da atividade da MPO no foco inflamatório, bem como, a contagem total e diferencial de leucócitos, principalmente neutrófilos. Quanto ao potencial antinociceptivo, a fração Glb (20mg/kg) reduzir a frequência de contorções induzidas por ácido acético (0,6%) em 83,46% em comparação ao grupo controle, no ensaio de formalina, ambas as frações foram capazes de reduzir o tempo que os camundongos permaneceram lambendo/mordendo suas patas (2ª fase do evento), sugerindo que sua ação não esteja associada com mecanismos centrais. Além disso, as frações mostraram atividade hemaglutinante contra todos os eritrócitos do sistema ABO, indicando a presença de lectinas nas frações. Análise do perfil cromatográfico mostra picos em ambas as frações, sugerindo a presença de lectinas, assim, justificando, as atividades anti-inflamatórias e antinociceptivas das frações Alb e Glb extraídas de sementes de Crotalaria retusa............ABSTRACT: Plants are importants sources of compounds with pharmacological actions. Studies report that proteins obtained seeds can have significant therapeutic actions as antifungal, antimicrobial, anti-inflammatory, antinociceptive and anti-cancer. Given this potential, the presente study aimed to evaluate the anti-inflammatory and antinociceptive activities of protein fractions obtained from Crotalaria retusa seeds. The C. retusa seeds were collected in Parnaíba-PI and crushed to form a fine-grained flour, which has been subjected to fractionation according to Osborne method. SDS-PAGE was performed to characterize the protein profile of the fractions Albumin (Alb) and Globulin (Glb). We conducted the hemagglutination test to investigate the presence of lectins. It was used affinity chromatography in guar gum column for purification of lectin present in the fractions. The anti-inflammatory activity of the fractions were evaluated by paw edema methods (induced by carrageenin and dextran) quantifying the activity of the enzyme myeloperoxidase (MPO) and carrageenan-induced peritonitis. The antinociceptive activity was evaluated by chemical stimulation test (writhing induced by acetic acid and formalin). Swiss females mice (Mus musculus) weighing between 25-28 g (n = 6) were used in the realization of all tests. These followed the Brazilian College of Animal Experimentation guidelines and the results expressed as mean ± standard error (ANOVA - Newman-Kleus; p <0.05). The analysis of the electrophoretic profiles showed that Alb and Glb fractions have at least four bands with molecular weights between 21.1 to 64.0 kDa. The results show that Alb and Glb fractions (5, 10 and 20mg/kg) administered intraperitoneally (ip) were able to reduce the formation of paw edema induced by carrageenan from the 2nd h of the test, and the dose of 20mg/kg both with the best reduction percentage of edema from the 3rd and 4th h, indicating that they may act by inhibiting leukocyte migration. This fact is supported and reinforced with the data from the quantification of the enzyme MPO and peritonitis. The dose of 20mg/kg (Alb and Glb) significantly reduced the quantification of MPO activity in the inflammatory site, as well as, the total and differential counts of leukocytes, especially neutrophils. Regarding the antinociceptive potential, Glb fraction (20 mg/kg) to reduce the frequency of writhing induced by acetic acid (0.6%) to 83.46% compared to the control group, in the formalin test, both fractions were able to reduce the time the mice remained licking/biting their paws (2nd phase of the event), suggesting that their action is not associated with central mechanisms. Furthermore, the fractions showed hemagglutinating activity against all of the ABO erythrocytes, indicating the presence of lectins in the fractions. Analysis of the chromatographic profile shows peaks in both fractions, suggesting the presence of lectins, thus explaining the anti-inflammatory and antinociceptive activities of Alb and Glb fractions extracted from Crotalaria retusa seeds.