EFEITO ANTISSECRETÓRIO DO SULFETO DE HIDROGÊNIO NA DIARREIA INDUZIDA PELA TOXINA DO Vibrio cholerae EM CAMUNDONGOS: EVIDÊNCIA DE NÃO ENVOLVIMENTO DA VIA ADENILATO CICLASE/AMPc/PKA E AMPK.

Abstract

RESUMO: A cólera é uma doença infecciosa aguda causada pela bactéria Vibrio cholerae, que se multiplica rapidamente no intestino humano produzindo a chamada toxina da cólera (TC). A TC causa uma diarreia grave devido a seu efeito direto sobre as células epiteliais intestinais, promovendo nestas uma ativação excessiva da adenilato ciclase (AC) e consequentemente um aumento dos níveis intracelulares de AMPc, que culminam com a secreção excessiva de Cl- que é acompanhada pelo movimento osmótico de uma grande quantidade de água para o lúmen intestinal. A solução de reidratação oral é o método mais eficaz para o tratamento da cólera, entretanto este não interfere no mecanismo de ação da TC. Portanto, é de suma importância o estudo sobre o desenvolvimento de fármacos e biomoléculas que possam agir no mecanismo intracelular dessa toxina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi estudar a atividade antidiarreica do sulfeto de hidrogênio (H2S) bem como o seu possível mecanismo de ação na diarreia secretória causada pela TC. Inicialmente, a atividade antidiarreica do H2S foi avaliada no modelo de secreção de fluido em alças intestinais isoladas de camundongos vivos tratadas com a TC. Assim, camundongos Swiss em jejum (24h), foram pré-tratados (v.o), com L-cisteína (10 ou 50 mg/kg) sozinha ou com DL-propargilglicina (PAG 100 mg/kg), NaHS (3 ou 27 μmol/kg), regente de Lawesson´s (3 ou 27 μmol/kg) ou salina, e 30 min. depois os animais foram anestesiados, seguido de uma incisão abdominal para isolar uma porção do jejuno (2-3cm). As alças intestinais foram então inoculados com 100 μl PBS ou TC (1 μg/alça). 4 h após a anestesia, os animais foram eutanasiados e as alças foram removidas para medida da relação g/cm das alças. Amostras teciduais das alças intestinais foram recolhidas para análise dos níveis de H2S e expressão intestinal de CSE através de imunohistoquímica. O conteúdo intestinal acumulado também foi recolhido para determinação da concentração de íons Cl-. Para determinar o papel do H2S na secreção intestinal induzida pela toxina da cólera, os animais foram pré-tratados com PAG (100 mg/kg) seguido da administração intraluminal de uma dose submáxima de toxina da cólera (0,5 μg/alça). O efeito da H2S sob a absorção intestinal também foi avaliado. Para o estudo do mecanismo de ação antidiarreica do H2S, os camundongos em jejum, foram pré-tratados (v.o) com PAG (100 mg/kg) ou salina. Após 25 min., foi realizado o procedimento da indução da diarreia na alça intestinal, entretanto, antes da administração da TC, os animais em determinados grupos receberam SQ22536 0,01M/alça (inibidor de AC), Bupivacaina 100μM/alça (inibidor de AMPc) ou KT5720 1μg/alça (inibidor de PKA). Para avaliar a participação da AMPK no efeito antissecretório do H2S, os animais foram tratados, com um ativador ou um inibidor específico da AMPK: AICAR (1mM/alça) e dorsomorfina (30μM/alça), respectivamente. Em seguida foi realizado o procedimento de indução da diarreia na alça intestinal isolada semelhante ao descrito anteriormente. O H2S por meio da L-cisteína e doadores apresentou atividade antidiarreica reduzindo significativamente a secreção de fluido intestinal e perda de íons Cl- induzida pela TC. Além disso, observou-se que o pré-tratamento com PAG seguido da administração de uma dose submáxima da TC, promoveu um aumento na secreção de fluido intestinal maior que o observado para o grupo tratado apenas com a toxina nessa dose. Esses dados indicam que o H2S é uma molécula essencial para a proteção contra os efeitos nocivos da TC. Foi observado também que TC induz um aumento da expressão de CSE, assim como da produção de H2S. Os dados desse trabalho também sugerem que o efeito antissecretório do H2S não está envolvido com o aumento da absorção intestinal e provavelmente ocorre por um mecanismo independente da via AC/AMPc/PKA e AMPK. Dessa forma, este estudo mostra a relevância da atividade antidiarreica H2S, e indica que drogas doadoras de H2S são candidatas promissores para a terapia da cólera. Porém mais estudos são necessários a fim de elucidar o possível mecanismo de ação do H2S na diarreia induzida pela TC................ABSTRACT: Cholera is an infectious disease caused by the bacterium Vibrio cholerae that multiplies fast in human bowel producing the called cholera toxin (CT). The CT causes severe diarrhea due to its direct effect on intestinal epithelial cells, promoting these excessive activation of adenylate cyclase (AC) and consequently an increase of the intracellular cAMP levels, culminating in excessive secretion of Cl- which is accompanied by the osmotic movement of a large quantity of water into the intestinal lumen. The oral rehydration solution is the most effective method for the treatment of cholera, however this does not interfere with the CT mechanism of action. Therefore, it is extremely important to study on the development of drugs and biomolecules that can act on intracellular mechanism of this toxin. Thus, the objective of this work was to study the antidiarrheal activity of hydrogen sulfide (H2S) and its possible mechanism of action in secretory diarrhea caused by CT. Initially, the antidiarrheal activity of H2S was evaluated in fluid secretion model in isolated intestinal loops of live mice treated with CT. Thus Swiss mice fasted (24h) were pretreated (v.o) with L-cysteine (10 or 50 mg/kg) alone or with DL-propargylglycine (PAG 100 mg/kg), NaHS (3 or 27 μmol/kg), Lawesson's regent (3 or 27 μmol/kg) or saline, and 30 min. later the animals were anaesthetized, followed by abdominal incision to isolate a portion of the jejunum (2-3 cm). The intestinal loops were then inoculated with 100 μl PBS or CT (1μg/loop). 4 h after anesthesia, the animals were euthanized and the loops were removed for measuring the g/cm ratio of the loops. Tissue samples from the intestinal loops were collected for analysis of levels of H2S and intestinal expression of CSE by immunohistochemistry. The accumulated intestinal contents was also collected for determination of the concentration of Cl- ions. For determine the role of H2S in cholera toxin-induced intestinal secretion, the animals were pretreated with PAG (100 mg/kg) followed by the intraluminal administration of a submaximal dose of cholera toxin (0.5 μg/loop). The effect of H2S in the intestinal absorption was also evaluated. To study the mechanism of action antidiarrheal H2S, mice fasted were pretreated (v.o) with PAG (100 mg/kg) or saline. After 25 min., was performed diarrhea inducing procedure in the intestinal loop, however, before administration of CT, the animals in certain groups received SQ22536 0.01M/loop (inhibitor AC), Bupivacaine 100μM/loop (inhibitor of cAMP) or KT5720 1μg/loop (PKA inhibitor). To evaluate the role of AMPK in the antisecretory effect of H2S, the animals were treated with an activator or a specific inhibitor of AMPK: AICAR (1 mM/loop) and dorsomorphine (30μM/loop), respectively. Then it was performed the diarrhea induced in isolated intestinal loop procedure similar to that described above. The H2S through L-cysteine and donor showed antidiarrheal activity significantly reducing the secretion of intestinal fluid and loss of Cl- ions induced by CT. Besides was observed that the pre-treatment with PAG followed by the administration of a submaximal dose of CT promoted an increase in intestinal fluid secretion higher than that observed for the group only treated with the toxin at this dose These data indicate that H2S is an essential molecule for protection against the damaging effects of CT. It has also been observed that CT induces an increase in CSE expression as well as H2S production. This work data also suggest that the effect of H2S antisecretory is not involved with the increase of intestinal absorption and probably occurs by a independent mechanim of pathway AC/cAMP/PKA and AMPK. Thus, this study shows the importance of antidiarrheal activity H2S, and indicates that H2S donor drugs are promising candidates for cholera therapy. However more studies are needed to elucidate the possible mechanism of action of H2S on diarrhea induced by CT.