AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ASSOCIADO À ALOE VERA EM SUBCUTÂNEO DE RATTUS NORVEGICUS

Abstract

1. RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar histológica e imuno-histoquimicamente a biocompatibilidade de uma pasta experimental composta por hidróxido de cálcio associado à Aloe vera em tecido subcutâneo de ratos. 45 animais foram divididos em três grupos, de acordo com os materiais testados (hidróxido de cálcio P.A. com Aloe vera, água destilada ou clorexidina 2%) e diferentes tempos experimentais (07, 15 e 30 dias). Tubos de polietileno com as pastas foram implantados no dorso dos animais. Nos tempos experimentais determinados as peças implantadas foram removidas e cortes foram realizados para a análise histológica e imunohistoquímica. Grupo 7 dias: O subgrupo controle apresentou exsudato rico em fibrina, com leve presença de células inflamatórias. O subgrupo da clorexidina apresentou leve infiltrado inflamatório com neoformação vascular e fibroblastos. O subgrupo Aloe vera, apresentou grande quantidade de fibras colágenas e acentuada migração de células polimorfonucleares para as proximidades dos vasos sanguíneos. Grupo 15 dias: o subgrupo controle apresentou leve formação de tecido de granulação e o subgrupo Aloe vera apresentou tecido conjuntivo com poucas células inflamatórias e fibras colágenas desorganizadas. O subgrupo clorexidina apresentou moderado infiltrado inflamatório. Em 30 dias todos os subgrupos apresentaram resultados semelhantes, tendo os subgrupos Aloe vera e clorexidina mostrado rara presença de núcleos corados com anticorpo contra ki-67. Conclui-se que o Aloe vera apresentou propriedades anti-inflamatórias e reparadoras que nos faz acreditar que o mesmo possa ser indicado.

A revisão de literatura foi realizada utilizando-se o portal de periódicos da Capes. Os seguintes descritores foram pesquisados: Calcium Hydroxide, Aloe, Biocompatible Materials, Dentistry e Endodontics.

1.1. Hidróxido de Cálcio O hidróxido de cálcio é atualmente utilizado em diversas formas, por meio de diferentes aplicações e em várias modalidades de tratamentos endodônticos. Formulações à base de Hidróxido de Cálcio (Ca(OH)2) são utilizadas para tratamento de perfurações , fraturas e reabsorções radiculares e tem um papel significativo na traumatologia dentária, por exemplo, após avulsão dentária e luxação. O Ca(OH)2 é uma substância de grande alcalinidade, com pH 12,5 que é um meio desfavorável para a maioria dos patógenos endodonticamente relevantes, e sua capacidade de ceder íons Ca++ aos tecidos confere uma ação antimicrobiana e indutora de mineralização a este material2. Os veículos inertes comumente utilizados em associação ao Ca(OH)2 são biocompatíveis, porém não influenciam na capacidade antimicrobiana deste; os mais comumente usados são a água destilada, o soro fisiológico, anestésicos, glicerina, óleo de oliva e propilenoglicol. Diferentemente dos veículos inertes, os veículos ativos contribuem com efeitos adicionais. O paramonoclorofenol, a clorexidina, a cresatina e o tricresol formalina constituem alguns desses veículos. Assim, a escolha do veículo dependerá do tipo de tratamento e da velocidade de dissociação iônica preconizada3, 4. Devido às suas propriedades antibacteriana, indutora de mineralização, biocompatível e antiinflamatória, o hidróxido de cálcio exerce atualmente um papel de extrema importância nos tratamentos endodônticos5 por apresentar características como: a) controle microbiano, b) dissolução de restos orgânicos, c) poder antiinflamatório, d) inibição de reabsorções inflamatórias6. Para comprovar tais propriedades, diversos estudos foram realizados. Em dentes permanentes com ápice aberto,há o estudo de Soares et al.7, no qual relataram um caso clínico sobre a apicificação induzida pelo hidróxido de cálcio. O paciente em questão possuia 10 anos de idade, tinha queixas de dor intensa e edema na região da face, compatível com um abscesso dento alveolar agudo. O dente 11 exibiu, radiograficamente, formação radicular incompleta, mostrada por uma radiolucência apical. Primeiramente o abcesso foi drenado e sanado. O tratamento de apicificação teve início na segunda sessão após 7 dias, utilizando-se preparo químico-mecânico, com limas K-File e irrigação com solução de hipoclorito de sódio 2,5%. Uma pasta à base de hidróxido de cálcio foi inserida no canal radicular e renovada diversas vezes em mais de 8 meses, até que o exame radiográfico revelou a total formação radicular. O canal radicular foi obturado pela compactação termomecânica da guta-percha e cimento. Após 3 da finalização do tratamento, constatou-se a normalidade dos tecidos e ausência de sintomatologia. Ainda com relação à dentes permanentes imaturos, foi feito um estudo que comparou os resultados clínicos do tratamento de apicigênese em 40 incisivos com apicificação incompleta utilizando-se hidróxido de cálcio ou agregado trióxido mineral (MTA) e concluiu-se que apesar de os incisivos com ápices abertos tratados com MTA formarem a barreira apical de tecido duro mais rapidamente, o alongamento e crescimento da raiz mostrou-se mais satisfatório nos dentes tratados com Ca(OH)2 8. Com relação à capacidade antimicrobiana, Mohammadi9 em 2012 elaborou uma revisão sobre o assunto, e dentre suas conclusões afirmou que o hidróxido de cálcio exerce efeitos antibacterianos no sistema de canais radiculares, enquanto um pH elevado é mantido; observou que canais radiculares tratados com Ca(OH)2 possuiam menos bactérias do que aqueles tratados com paramonoclorofenol canforado ou monoclorofenol canforado e comentou que para o hidróxido de cálcio ser eficaz na prevenção do crescimento de microorganismos, há a necessidade do contato direto para atingir o efeito antibacteriano ideal9. Pattama et al.10 estudaram a eficácia do Ca(OH)2 no tratamento de revascularização. O objetivo do estudo foi investigar a capacidade de fixação das células papilares apicais (APCs) humanas viáveis, ​​utilizando-se para a análise a técnica de imunofluorescência, o ensaio de Alamar Azul, e a digitalização por microscopia eletrônica. APCs foram cultivadas em superfícies de dentina radicular tratadas com a pasta 3Mix-MP ou com Ca(OH)2 em diferentes concentrações. Após as análises os autores concluíram que um maior número de células ligadas foi observado nos grupos cuja superfície foi tratada com Ca(OH)2. A eficácia do Ca(OH)2 quando utilizado sozinho, porém, vem sendo questionada. Kim & Kim11 fizeram uma revisão de literatura sobre o efeito antimicrobiano de tal substância como medicação intracanal por meio de estudos in vitro e concluíram que as pesquisas mostraram resultados variados e conflitantes. Embora alguns tenham confirmado o efeito antimicrobiano do Ca(OH)2, outros questionaram sua eficácia. A primeira parte da revisão relaciona o efeito antimicrobiano do Ca(OH)2 com os íons hidroxila liberados em meio aquoso, o que afeta membranas citoplasmáticas, proteínas e o DNA de microrganismos, porém ele é menos eficaz contra espécies específicas, tais como E. faecalis ou C. albicans. A adição de veículos ou outros agentes podem contribuir para o efeito antimicrobiano do Ca(OH)2. Isso posto, diversos trabalhos foram feitos adicionando substâncias ao Ca(OH)2, um deles12 utilizou a clorexidina como princípio ativo junto ao Ca(OH)2 como pasta para tratamento de necrose pulpar em dentes decíduos. Amostras microbiológicas foram coletadas antes e depois do tratamento endodôntico e em seguida analisadas. Concluiu-se que o Ca(OH)2 associado à Clorexidina tem maior eficácia do que o Ca(OH)2 com um veículo inerte, agindo tanto na diminuição da carga bacteriana total, como também contra microrganismos gram positivos e gram negativos.

1.2. Clorexidina A clorexidina é definida como um detergente catiônico, da classe das bisbiguanidas, disponível nas formas de acetato, hidrocloreto e digluconato, que é a forma de apresentação do produto mais utilizada na odontologia. Ela foi sintetizada por volta dos anos 40 e introduzida no mercado em 1954 como um antisséptico para ferimentos na pele13. Diversas utilidades para a clorexidina foram sugeridas ao longo dos anos, por exemplo, uso em espermicidas para impedir a transmissão do vírus HIV14, uso para a preparação de pacientes em procedimentos15, para anti-sepsia da pele das mãos e em tratamentos de feridas e queimaduras16,17. Além disso, a OMS recomenda clorexidina para a limpeza de cordões umbilicais, pois esta pode reduzir significativamente o risco de onfalite18. Stevens e colaboradores19, Ha Y Cheung e Abad-Villar e colaboradores20 descreveram a utilização de clorexidina em soluções para desinfetar lentes de contato, devido à sua baixa toxicidade. Na odontologia, é utilizada como um antisséptico bucal para prevenção da formação de placa dentária e gengivite e para eliminar patógenos orais21,22. Apresenta efeito sobre bactérias gram positivas, gram negativas, fungos, leveduras e vírus lipofílicos, é considerada um antimicrobiano de amplo espectro de ação23. Löe e Rindom Schiott24 foram dos primeiros pesquisadores que demonstraram que colutórios de uma solução de gluconato de clorexidina a 0,2% mostraram eficácia na diminuição do crescimento do biofilme bacteriano e, consequentemente, melhoras dos quadros de gengivite clinicamente detectáveis. Além de seu uso na periodontia, a clorexidina é uma substância amplamente utilizada nos tratamentos endodônticos. Por exemplo, na forma de gluconato de clorexidina, ela pode ser utilizada como um irrigante ou medicação intracanal, devido à sua biocompatibilidade, substantividade e ampla atividade antimicrobiana25,26 Sua propriedade antimicrobiana é atribuída à presença de uma molécula catiônica em sua estrutura, que é adsorvida pelas células da membrana interna dos microorganismos, devido à presença de carga negativa nas mesmas. A consequência desse fenômeno é a fuga de componenetes intracelulares. Portanto, é um agente eficaz contra bactérias gram positivas e gram negativas27. A associação da clorexidina com outras substâncias também já foi estudada, dentre elas, o Ca(OH)2 . Saatchi e colaboradores28 em 2014 realizaram uma revisão sistemática e metanálise sobre o efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio associado à clorexidina contra o Enterococcus feacalis e concluíram que a pasta não foi mais efetiva do que o Ca(OH)2 puro em amostras ex vivo.

1.3. Aloe vera Atualmente, o estudo da fitoterapia em programas preventivos e curativos tem estimulado a avaliação da atividade de diferentes extratos de plantas. O hábito de empregar o uso de plantas no restabelecimento da saúde pelos próprios membros da comunidade, comum a todos os povos e quase esquecido por décadas, vem, nos últimos anos, se tornando importante. No entanto, o emprego correto de plantas para fins terapêuticos requer o uso de plantas selecionadas para sua eficácia e segurança, cientificamente validadas como medicinais29. Capazes de proporcionar importantes propriedades anti-inflamatórias, antibacterianas, antifúngicas, hipoglicêmicas e antidiabéticas, imunomoduladoras, cicatrizantes e regenerativas30, as espécies de plantas do gênero Aloe (Liliaceae) têm sido estudadas, devido às suas propriedades medicinais, incluindo a Aloe vera, uma espécie que contém substâncias biologicamente ativas31. Sobre sua capacidade redutora da inflamação, sabe-se que o produto inibe a via cicloxigeanase e reduz a prostaglandina E2, além de possuir em sua composição o composto anti–inflamatório conhecido por cromona C – glicosilo32. Além disso, as enzimas bradiquinase e peptidase foram isoladas a partir do extrato Aloe, substâncias responsáveis pela quebra da bradicinina, uma substância inflamatória que induz a dor33. Gupta & Malhotra em 2012 elaboraram um estudo sobre os atributos farmacológicos da Aloe vera. Com base no material estudado, conclui-se que a Aloe possui diferentes mecanismos que proporcionam efeitos terapêuticos em feridas que incluem manter a ferida úmida, aumentar a migração celular epitelial, promover uma rápida maturação de colagénio e promover a redução da inflamação34. A capacidade antifúngica da Aloe foi estudada por meio da extração de nanopartículas de prata de folhas de Aloe vera e utilização destas contra dois patógenos: Rhizopus sp. e Aspergillus sp. As nanopartículas preparadas foram caracterizadas por SEM, FT-IR e por espectroscopia de UV-Vis. A partir da microscopia de varredura foi possível evidenciar que as partículas são heterogéneas em forma, tais como retangular, triangulares e esféricas com uma distribuição uniforme. O estudo de FT-IR revelou picos de absorção em 1,631 e 3,433 cm-1 para os grupos amida e hidroxilas, respectivamente. Dessa forma, os autores concluíram que nanopartículas de prata originadas da folha de Aloe vera possuem grande potencial antifúngico35. Suas propriedades antivirais auxiliam no tratamento de herpes simples e infecções de herpes zoster. Áreas de ferida da mucosa oral que são cobertos por próteses podem ser tratadas com géis à base de aloe, já que, como dito acima, é um ótimo agente antifúngico. Além disso, reduzem a dor associada a úlceras nas comissuras bucais36. Além de antifúngica, a Aloe atua sobre a síntese de fibras colágenas, consequentemente, no reparo tecidual, como foi comprovado por Aro e colaboradores, em 2012. Para chegar a tal conclusão, os pesquisadores seccionaram parcialmente o tendão calcâneo de ratos, aplicando em seguida uma pomada de ação tópica à base de Aloe. Os animais foram, então, separados em dois grupos: o primeiro com tendões tratados com o extrato de Aloe e o segundo, controle, tratado com pomada sem extrato. As análises dos resultados indicaram um efeito benéfico da aloe na reorganização do tecido na região seccionada do tendão, 21 dias após a lesão, suportado por um aumento de metaloproteinase do tipo 237. A cicatrização de lesões tardias causadas por radiação aguda também se mostrou acelerada após o uso da Aloe, ação comprovada devido ao aumento da produção de fator transformador de crescimento β-1 (TGF-β-1) e da produção de fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) 38. Na odontologia, as pesquisas com Aloe vera também mostraram resultados promissores, por exemplo, propriedades antissépticas e anti-inflamatórias, úteis no tratamento da gengivite. Estudos clínicos comprovam que bochechos e dentifrícios contendo aloe vera têm mostrado uma redução notável na gengivite e acúmulo de placa após a sua utilização39,40. Estudos realizados por Gita Bhatt et al. revelaram que o uso de gel de aloe vera administrado subgengivalmente apresentou resultados promissores no tratamento de bolsas periodontais41. Kriplani e colaboradores42, em 2013, realizaram um estudo comparando a ação antimicrobiana de diversos materiais endodônticos. Aloe vera com água destilada, óxido de zinco e eugenol associado e não associado ao Aloe vera hidróxido de cálcio com água destilada e Aloe vera, Hidróxido de cálcio com água destilada e Hidróxido de cálcio com iodofórmio e vaselina foram os materiais analisados. O trabalho concluiu que todos os materiais, exceto a vaselina, mostraram alguma eficácia contra as bactérias, porém o grupo com a atividade antimicrobiana superior foi o que utilizou Aloe vera com água destilada, seguido dos grupos óxido de zinco e eugenol + Aloe vera, óxido de zinco e eugenol e hidróxido de cálcio com água destilada. O grupo com hidróxido de cálcio, iodofórmio e vaselina não mostrou resultados significantes42. A aloe também foi testada em dentes decíduos. Khairwa e colaboradores43 avaliaram clínica e radiograficamente uma pasta à base de óxido de zinco e eugenol e aloe vera como um material de obturação de dentes decíduos. Para isso foram selecionadas 50 crianças com idades entre 4 e 9 anos apresentando molares decíduos comprometidos. Destas, 15 crianças foram selecionadas aleatoriamente para o tratamento endodôntico. A obturação foi feita com uma mistura de pó de óxido de zinco e o gel de aloe vera. A avaliação clínica e radiográfica foi realizada após 7 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses e 9 meses e concluiu-se que o tratamento endodôntico utilizando uma mistura a pasta mostrou sucesso clínico e radiográfico.