RT-PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO SIMULT FEIJÃO-CAUPI

Abstract

RESUMO As fitoviroses representam uma ameaça à segurança alimentar da população mundial. As consequências econômicas e sociais tendem a ser mais evidentes em regiões tropicais e subtropicais do globo, onde a subsistência da maioria da população depende da agricultura. Nesse contexto, torna-se importante desenvolver estratégias eficazes para diagnosticar e manejar essas doenças. No presente estudo, foi desenvolvido um protocolo RT-PCR Multiplex para a detecção simultânea de cowpea severe mosaic virus (CPSMV), cucumber mosaic virus (CMV) e cowpea mild mottle virus (CPMMV). Os isolados de CPSMV, CMV e CPMMV foram obtidos de plantas de feijão-fava. Para a síntese das moléculas de DNA complementar (cDNA) foram utilizados oligonucleotídeos específicos para cada vírus, além de oligonucleotídeos para detecção do mRNA vegetal endógeno denominado NADH desidrogenase subunidade. O protocolo de reação para a PCR Multiplex foi otimizado para a amplificação dos três conjuntos de oligonucleotídeos com seus respectivos cDNAs alvo em uma única reação. Foram realizados ensaios de especificidade e sensibilidade dos pares de oligonucleotídeos utilizados para cada espécie de vírus, além de temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos. Amostras foliares de feijão-caupi com sintomas característicos de virose foram coletadas em dez produtores, distribuídos em cinco municípios nos estados do Piauí e Maranhão. A confirmação da ocorrência e da incidência das diferentes espécies de vírus foi realizada por RT-PCR Multiplex, assim como por RT-PCR Simplex. As amostras também foram analisadas por RT-PCR com oligonucleotídeos degenerados para o gênero Comovirus e oligonucleotídeos específicos para cowpea aphid borne mosaic virus (CABMV). Os três pares de oligonucleotídeos amplificaram fragmentos de tamanhos esperados, isto é, 300 pb, 500 pb e 890 pb para CMV, CPMMV e CPSMV, respectivamente, quando utilizados na amplificação dos alvos de forma separada. A temperatura de anelamento ótima para a RT-PCR Multiplex foi 52 ºC. O limite de detecção para o CPMMV na RT-PCR Simplex foi o mesmo para a RT-PCR Multiplex. Porém, para o CMV e CPSMV, os limites de detecção da RT-PCR Simplex foram maiores quando comparados com a RT-PCR Multiplex. A capacidade do ensaio RT-PCR Multiplex de detectar CPSMV, CMV e CPMMV simultaneamente em um único ensaio, em vez dos ensaios simples correspondentes, proporcionou uma economia de aproximadamente 70% do tempo de detecção, 20% do volume da Taq DNA polimerase, 12,5% do volume de dNTPs e 7,14% do volume dos oligonucleotídeos. Os resultados das análises de RT-PCR Multiplex em amostras de campo revelaram que as incidências de infecção única foram de 67,8% (59 em 87 amostras) para CPSMV, 40,2% (35/87) para CMV e nenhuma infecção (0,0%) para CPMMV. No âmbito das coinfecções, verificou-se que 24,1% (21/87) amostras estavam infectadas simultaneamente com CPSMV e CMV. Esses resultados contribuirão para tornar a diagnose de CPSMV, CMV e CPMMV um processo mais ágil e menos oneroso, além de subsidiar a geração de conhecimentos sobre a epidemiologia desses patógenos em campo.

ABSTRACT Plant viruses represent a threat to the food security of the world's population. The economic and social consequences tend to be more evident in tropical and subtropical regions of the globe, where the subsistence of the majority of the population depends on agriculture. In this context, it becomes important to develop effective strategies for diagnosing and managing these diseases. In the present study, a Multiplex RT-PCR protocol was developed for the simultaneous detection of cowpea severe mosaic virus (CPSMV), cucumber mosaic virus (CMV), and cowpea mild mottle virus (CPMMV). Isolates of CPSMV, CMV, and CPMMV were obtained from fava bean plants. Specific oligonucleotides for each virus were used for the synthesis of complementary DNA (cDNA), along with oligonucleotides for the detection of the endogenous plant mRNA named NADH dehydrogenase subunit. The reaction protocol for Multiplex PCR was optimized for the amplification of the three sets of oligonucleotides with their respective target cDNAs in a single reaction. Specificity and sensitivity assays of the oligonucleotide pairs used for each virus species were performed, as well as annealing temperature optimization for the oligonucleotides. Leaf samples from cowpea plants with characteristic virus symptoms were collected from ten producers, distributed in five municipalities in the states of Piauí and Maranhão. Confirmation of the occurrence and incidence of the different virus species was performed by Multiplex RT-PCR, as well as Simplex RT-PCR. The samples were also analyzed by RT-PCR with degenerate oligonucleotides for the Comovirus genus and specific oligonucleotides for cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). The three pairs of oligonucleotides amplified fragments of expected sizes, i.e., 300 bp, 500 bp, and 890 bp for CMV, CPMMV, and CPSMV, respectively, when used for separate target amplification. The optimal annealing temperature for Multiplex RT-PCR was 52°C. The detection limit for CPMMV in Simplex RT-PCR was the same as for Multiplex RT-PCR. However, for CMV and CPSMV, the detection limits of Simplex RT-PCR were higher when compared to Multiplex RT-PCR. The capability of the Multiplex RT-PCR assay to detect CPSMV, CMV, and CPMMV simultaneously in a single assay, instead of the corresponding single assays, provided approximately 70% time savings, 20% volume savings of Taq DNA polymerase, 12.5% volume savings of dNTPs, and 7.14% volume savings of oligonucleotides. The results of Multiplex RT-PCR analyses on field samples revealed that the incidences of single infection were 67.8% (59 out of 87 samples) for CPSMV, 40.2% (35/87) for CMV, and no infection (0.0%) for CPMMV. Regarding coinfections, it was found that 24.1% (21/87) of samples were simultaneously infected with CPSMV and CMV. These results will contribute to making the diagnosis of CPSMV, CMV, and CPMMV a more agile and less expensive process, as well as to support the generation of knowledge about the epidemiology of these pathogens in the field.