EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DO DIAZINON, TROLOX, GENISTEÍNA E RESVERATROL, AO DILUIDOR TRIS-GEMA, NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO

Abstract

RESUMO Com o avanço das biotécnicas reprodutivas e do melhoramento animal, em todas as espécies de interesse econômico, o aprimoramento das técnicas de conservação de germoplasma se tornaram cada vez mais necessárias. A criopreservação de sêmen é uma dessas principais técnicas de conservação, no entanto, elas geram danos irreversíveis nas células espermáticas, a exemplo da lipoperoxidação, causada por espécies reativas ao oxigênio (EROs). Diante disso, se faz necessário o estudo de métodos que atenuem esses danos e aumentem a qualidade final do material criopreservado. Dessa forma, objetivou-se avaliar o efeito do estresse subletal, por meio da suplementação com Diazinon (120 μM), assim como o efeito dos agentes antioxidantes Trolox (75 μM), Genisteína (25 μM) e Resveratrol (20 μM), no diluidor TRIS-gema, sobre a qualidade do sêmen criopreservado de ovinos. Para tanto, foram coletadas amostras de sêmen de seis carneiros da raça Dorper clinicamente saudáveis e com os parâmetros andrológicos/seminais normais. O sêmen foi diluído em diluidor Tris-Gema com glicerol e os respectivos tratamentos, em cada experimento. Experimento 1: Controle (Tris-Gema), T1 (Tris-Gema + 120 µM de Diazinon); T2 (Tris-Gema + 75 µM de Trolox). Experimento 2: Controle (Tris-Gema); T1 (Tris-Gema + 25 µM de Genisteína); T2 (Tris-Gema + 20 µM de Resveratrol). Posteriormente, foram realizadas as análises macro e microscópicas do ejaculado pré e pós-diluição. As amostras foram criopreservadas pelo método automatizado, em curva de congelação lenta para a espécie ovina e, após 15 dias, foram realizadas as seguintes análises pós-descongelamento: análise física, avaliação da longevidade espermática pelo teste de termorresistência (TTR), avaliação morfológica pós-descongelação, avaliação da ultraestrutura espermática: integridade da membrana plasmática, integridade acrossomal, atividade mitocondrial e funcionalidade da membrana plasmática espermática. Foi utilizado no estudo o delineamento inteiramente casualizado (DIC), os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey e Duncan, com um nível de significância de 5%. Observou-se um aumento significativo do vigor espermático no tratamento com Resveratrol, quando comparado ao sêmen pré-congelação (p<0,05). Os tratamentos não geraram alterações nos parâmetros da ultraestrutura espermática (p>0,05). Não houve diferença entre os tratamentos na avaliação da longevidade espermática pelo TTR, no entanto, houve estabilizações na motilidade e vigor espermáticos entre os tempos do TTR (p<0,05). Não houve diferença entre os tratamentos na análise de morfologia espermática do sêmen criopreservado. A funcionalidade da membrana plasmática foi reduzida nos grupos com 120 µM de Diazinon e 25 µM de Genisteína adicionadas meio diluidor. Não houve diferença entre os tratamentos na avaliação dos parâmetros cinéticos pelo CASA (p>0,05), com exceção da motilidade progressiva do T1 (Tris-Gema + 120 µM de Diazinon) que se mostrou reduzida em relação ao controle (p<0,05). Em conclusão, a suplementação de 120 μM de Diazinon ao meio diluidor Tris-Gema, não melhorou a cinética espermática bem como a qualidade estrutural dos espermatozoides criopreservados e a adição de 75 µM de Trolox manteve a qualidade espermática. A adição de 25 µM de Genisteína, ao diluidor Tris-Gema, mantém os parâmetros cinéticos espermáticos em relação ao controle, porém a suplementação de 20 µM de Resveratrol ao diluidor foi capaz de melhorar o vigor espermático do sêmen ovino criopreservado.

ABSTRACT With the advancement of reproductive biotechniques and animal improvement, in all species of economic interest, the improvement of germplasm conservation techniques has become increasingly necessary. Semen cryopreservation is one of these main conservation techniques, however, they generate irreversible damage to sperm cells, such as lipoperoxidation, caused by reactive oxygen species (ROS). Therefore, it is necessary to study methods that mitigate these damages and increase the final quality of the cryopreserved material. Thus, the objective was to evaluate the effect of sublethal stress, through supplementation with Diazinon (120 μM), as well as the effect of the antioxidant agents Trolox (75 μM), Genistein (25 μM) and Resveratrol (20 μM), on TRIS-yolk extender on the quality of cryopreserved ram semen. For this purpose, semen samples were collected from six clinically healthy Dorper rams with normal andrological/seminal parameters. The semen was diluted in Tris-Gema extender with glycerol and the respective treatments, in each experiment. Experiment 1: Control (Tris-Gem), T1 (Tris-Gem + 120 µM Diazinon); T2 (Tris-Gem + 75 µM Trolox). Experiment 2: Control (Tris-Gema); T1 (Tris-Gem + 25 µM Genistein); T2 (Tris-Gem + 20 µM Resveratrol). Subsequently, macro and microscopic analyzes of the pre- and post-dilution ejaculate were carried out. The samples were cryopreserved by the automated method, in a slow freezing curve for the ovine species and, after 15 days, the following post-thawing analyzes were carried out: physical analysis, evaluation of sperm longevity by the thermoresistance test (TTR), post morphological evaluation -thawing, evaluation of sperm ultrastructure: plasma membrane integrity, acrosomal integrity, mitochondrial activity and sperm plasma membrane functionality. The study used a completely randomized design (DIC), the data were submitted to analysis of variance and the averages compared by the Tukey and Duncan test, with a significance level of 5%. There was a significant increase in sperm vigor in the treatment with Resveratrol, when compared to pre-freezing semen (p<0.05). Treatments did not change sperm ultrastructure parameters (p>0.05). There was no difference between treatments in the evaluation of sperm longevity by TTR, however, there were stabilizations in sperm motility and vigor between TTR times (p<0.05). There was no difference between treatments in sperm morphology analysis of cryopreserved semen. Plasma membrane functionality was reduced in the groups with 120 µM Diazinon and 25 µM Genistein added to extender medium. There was no difference between treatments in the evaluation of kinetic parameters by CASA (p>0.05), with the exception of the progressive motility of T1 (Tris-Gem + 120 µM of Diazinon) which was reduced in relation to the control (p<0 .05). In conclusion, the supplementation of 120 μM of Diazinon to the Tris-Gema extender medium, did not improve the sperm kinetics as well as the structural quality of the cryopreserved spermatozoa and the addition of 75 µM of Trolox maintained the sperm quality. The addition of 25 µM of Genistein, to the extender Tris-Gema, maintains the sperm kinetic parameters in relation to the control, however the supplementation of 20 µM of Resveratrol to the extender was able to improve the sperm vigor of cryopreserved ram semen.