CITOGENÉTICA E VIABILIDADE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ADIPODERIVADAS DE RATOS EM CULTIVO COM HIDROGEL DE GELATINA METACRILATA (GELMA)

Abstract

RESUMO A associação de células-tronco mesenquimais (MSC) com biomateriais vem sendo investigada, com o objetivo de reduzir o tempo e melhorar a qualidade cicatricial de diversos tecidos do organismo. A regeneração óssea representa um importante desafio na ortopedia, ortodontia e traumatologia, humana e veterinária. A terapia com células-tronco mesenquimais vem complementar a utilização dos biomateriais, com a sua propriedade de osteogênese, transformando um biomaterial primariamente osteoindutor em um substituto ósseo completo, comparável a enxertia óssea autógena, porém sem as morbidades dessa cirurgia. Entretanto, é necessário avaliar a biocompatibilidade e os possíveis efeitos tóxicos da associação dessas células com os biomatreiais, sendo imprescindíveis testes in vitro, pois são muitos os fatores que podem causar danos no DNA. Dessa forma, este estudo tem como objetivo avaliar a cito e genotoxicidade, e a biocompatibilidade do Hidrogel de gelatina metacrilata (GelMA) a 1% e 3% associado a cultura de células-tronco mesenquimais adipoderivadas (ADSC), mediante teste citogenético por Ensaio Cometa e viabilidade celular por MTT, além de analisar o potencial osteogênico desse biomaterial. As ADSCs foram isoladas de tecido adiposo de rato (Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA/UFPI-658/20) por digestão enzimática utilizando colagenase I e mantidas em cultivo em meio DMEM enriquecido com PBS (15%), incubadas a 37oC, 5% CO2. As ADSCs foram caracterizadas por citometria de fluxo, apresentando marcação positiva para CD90 e CD105, e negativa para CD14 e CD45. A plasticidade dessas células foi comprovada por meio da diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica. O GelMA foi preparado dissolvendo-se 0,1g em 5mL de PBS, usando Igarcure 2959 como fotoiniciador a 40oC, agitado mecanicamente e reticulado em luz UV para formação do hidrogel. O material foi caracterizado por FTIR, DRX, TG/DTG e MEV. O teste letalidade por Artemia salina foi realizado em quatro concentrações diferentes (5mg/mL; 1mg/mL; 0,5mg/mL e 0,1mg/mL) em 24h e 48h, apresentando leve toxicidade do GelMA na sua maior concentração (5mg/mL), porém, ainda acima da DL50 (dose letal média). No teste de MTT apenas o GelMA1% apresentou viabilidade celular acima de 70% em todos os tempos estudados, não apresentando potencial citototóxico para as ADSCs. No ensaio cometa o hidrogel de GelMA a 1% e 3% não demonstrou potencial genotóxico as ADSCs, não induzindo danos estatisticamente significativos no DNA dessas células. Na indução osteogênica das ADSCs com o GelMA 1% e 3%, verificou-se que o biomaterial não é capaz de promover a diferenciação celular na ausência de um fator indutor. Conclui-se que a associação do hidrogel de GelMA com ADSCs é promissora, pois é capaz de interagir positivamente e facilita a adesão celular. Biocompatível, não apresentando cito e genotoxicidade às células, permitindo futuros estudos in vivo.

ABSTRACT The association of mesenchymal stem cells (MSC) with biomaterials has been investigated, with the aim of reducing time and improving the healing quality of various body tissues Bone regeneration still represents a challenge in orthopedics, orthodontics and traumatology. Therapy with mesenchymal stem cells complements the use of biomaterials, with their osteogenesis property, transforming a primarily osteoinductive biomaterial into a complete bone substitute, comparable to autogenous bone grafting, but without the morbidities of this surgery. However, it is necessary to evaluate the biocompatibility and the possible toxic effects of the association of these cells with the biomaterials, being essential in vitro tests, since there are many factors that can cause DNA damage. Thus, this study aims to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity, and the biocompatibility of the 1% and 3% methacrylate gelatin hydrogel (GelMA) associated with the culture of adipoderivative mesenchymal stem cells (ADSC), through cytogenetic test by Comet Assay and cell viability by MTT, in addition to analyzing the osteogenic potential of this biomaterial. The ADSCs were isolated from rat adipose tissue (Commission for Ethics in Animal Use - CEUA/UFPI-658/20) by enzymatic digestion using collagenase I and maintained in culture in DMEM medium enriched with PBS (15%), incubated at 37oC , 5% CO2. ADSCs were characterized by flow cytometry, showing positive staining for CD90 and CD105, and negative for CD14 and CD45. The plasticity of these cells was proven through adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. GelMA was prepared by dissolving 0.1g in 5mL of PBS, using Igarcure 2959 as a photoinitiator at 40oC, mechanically stirred and cross-linked under UV light to form the hydrogel. The material was characterized by FTIR, XRD, TG/DTG and SEM. The lethality test for Artemia salina was performed at four different concentrations (5mg/mL; 1mg/mL; 0.5mg/mL and 0.1mg/mL) in 24h and 48h, showing mild toxicity of GelMA at its highest concentration (5mg/mL). mL), however, still above the LD50 (mean lethal dose). In the MTT test, only GelMA1% showed cell viability above 70% at all times studied, not showing cytotoxic potential for ADSCs. In the comet assay, the 1% and 3% GelMA hydrogel did not demonstrate genotoxic potential for ADSCs, not inducing statistically significant damage to the DNA of these cells. In the osteogenic induction of ADSCs with GelMA 1% and 3%, it was verified that the biomaterial is not able to promote cell differentiation in the absence of an inducing factor. It is concluded that the association of GelMA hydrogel with ADSCs is promising, as it is capable of positively interacting and facilitates cell adhesion. Biocompatible, not showing cytotoxicity and genotoxicity to cells, allowing future in vivo studies.