CITOTOXICIDADE E GENOTOXICIDADE DA LAPONITA EM CULTURAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

Abstract

RESUMO As Células-tronco mesenquimais são células indiferenciadas, que constituem ferramenta promissora no campo da medicina regenerativa, pois possuem capacidade de multiplicação mantendo seu estado indiferenciado, além da renovação de diversos tecidos, por meio de sua diferenciação celular. A laponita é uma nanoargila sintética, utilizada em diversas aplicações industriais e possui características que possibilitam sua utilização na engenharia de tecidos. Recentemente, foram publicados estudos que comprovam a capacidade da laponita em induzir a diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais in vitro, o que a torna um material apropriado para a engenharia de tecidos ósseos. No entanto, pouco se sabe quanto as reações imunológicas desencadeadas por potenciais citotóxicos e genotóxicos que essa interação pode proporcionar. Assim, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a toxicidade em nível celular e genômico, da integração da laponita em culturas de células-tronco adipoderivadas de ratos, sob autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFPI, n. 665/21. A caracterização físico-química da Laponita® foi realizada por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier, análise termogravimétrica, difração de raios X, e micrografias foram realizadas em microscópio eletrônico de varredura. O material também passou por uma triagem citotóxica por meio do ensaio de letalidade Artemia salina. O tecido adiposo foi coletado e as células foram cultivadas a 5% de CO2 a 37°C. Para caracterização celular foram realizados os testes de morfologia e UFC, além da imunofenotipagem por citometria de fluxo, para os anticorpos CD14, CD45, CD90 e CD105. Ainda, o ensaio de plasticidade celular, mediante indução para diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, além da avaliação do potencial de diferenciação osteogênica da Laponita® presente no meio. As células foram cultivadas com a Laponita® em concentrações de 3% e 6% em três tempos distintos para análise de citotoxicidade por MTT. A análise de genotoxicidade foi conduzida por meio do ensaio cometa para avaliar danos e reparos no DNA em células individuais. Na caracterização do material obteve-se resultados semelhantes aos encontrados na literatura, quando se evidencia a estrutura química cristalina e organizada. Nas análises termogravimétricas, a temperatura de degradação mostrou-se em conformidade com dados observados em outros estudos. No relativo à toxicidade, a laponita obteve resultados abaixo da CL50. As células-tronco mesenquimais mostraram-se com morfologia fibroblastóide, e apresentaram os anticorpos CD14-, CD45-, CD90+ e CD105+. Demonstraram capacidade de diferenciar-se em linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Em culturas contendo a laponita, a diferenciação foi possivelmente potencializada. Quanto à citotoxicidade, o material apresentou baixos resultados e houve aumento da viabilidade celular em todos os tempos analisados. A genotoxicidade entre a interação da célula com a Laponita® não demonstrou diferenças estatisticamente significativas entre o índice de dano e os grupos experimentais, porém, quanto a frequência de dano, a Laponita® 6% difere quando comparada Laponita® 3% em maior tempo de exposição. Com base neste estudo, conclui-se que a Laponita® representa um biomaterial potencialmente útil para a terapia celular.

ABSTRACT Mesenchymal stem cells are undifferentiated cells, which are a promising tool in the field of regenerative medicine, as they have the ability to multiply while maintaining their undifferentiated state, in addition to renewing various tissues through their cell differentiation. Laponite is a synthetic nanoclay, used in several industrial applications and has characteristics that allow its use in tissue engineering. Recently, studies have been published that prove the ability of laponite to induce osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in vitro, which makes it an appropriate material for bone tissue engineering. However, little is known about the immunological reactions triggered by cytotoxic and genotoxic potentials that this interaction can provide. Thus, this work was carried out with the objective of evaluating the toxicity, at cellular and genomic level, of the integration of laponite in cultures of adipoderivative stem cells of rats, under authorization of the Ethics Commission in the Use of Animals (CEUA) of the UFPI, n . 665/21. The physical-chemical characterization of Laponita® was performed by Fourier transform infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis, X-ray diffraction, and micrographs were performed in a scanning electron microscope. The material also underwent cytotoxic screening using the Artemia salina lethality assay. Adipose tissue was harvested and cells were cultured at 5% CO2 at 37°C. For cell characterization, morphology and CFU tests were performed, in addition to immunophenotyping by flow cytometry, for antibodies CD14, CD45, CD90 and CD105. Still, the cellular plasticity test, through induction for osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation, in addition to the evaluation of the osteogenic differentiation potential of Laponita® present in the medium. Cells were cultured with Laponita® at concentrations of 3% and 6% at three different times for analysis of cytotoxicity by MTT. Genotoxicity analysis was conducted using the comet assay to assess DNA damage and repair in individual cells. In the characterization of the material, results similar to those found in the literature were obtained, when the crystalline and organized chemical structure is evidenced. In thermogravimetric analyses, the degradation temperature was in accordance with data observed in other studies. Regarding toxicity, laponite obtained results below the LC50. Mesenchymal stem cells showed fibroblastoid morphology, and presented CD14-, CD45-, CD90+ and CD105+ antibodies. They demonstrated the ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. In cultures containing laponite, differentiation was possibly enhanced. As for cytotoxicity, the material showed low results and there was an increase in cell viability at all times analyzed. The genotoxicity between the interaction of the cell with Laponita® did not show statistically significant differences between the damage index and the experimental groups, however, regarding the frequency of damage, Laponita® 6% differs when compared to Laponita® 3% in greater time of exhibition. Based on this study, it is concluded that Laponita® represents a potentially useful biomaterial for cell therapy.