ESTRESSE OXIDATIVO E INTEGRIDADE GENÔMICA IN SITU E IN VITRO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS E PROGENITORAS RENAIS NA REGENERAÇÃO DA ISQUEMIA/REPERFUSÃO EM RIM SUÍNO

Abstract

RESUMO: A terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) e células progenitoras renais (CPR) tem demonstrado interesse crescente devido a sua possível capacidade regenerativa e imunossupressora em diversas nefropatias, incluindo na lesã o de isquemia-reperfusão renal (IRR). Contudo, para a aplicação clínica dessas células deve haver uma extensa segurança com estudos direcionados a manutenção das condições de cultivo durante sua expansão e com observância em ensaios clínicos experimentais. O objetivo deste estudo foi avaliar o estresse oxidativo e os danos ao DNA das células-tronco mesenquimais e progenitoras renais in vitro e in situ, com análise da proliferação, apoptose e angiogênese em suínos submetidos à lesão de isquemia-reperfusão renal. Foram utilizadas CTM da medula óssea e CPR do córtex renal de suínos utilizando passagens precoce, terapêutica e tardia para análise do cultivo durante a expansão. Para avaliação in situ, 15 suínos foram submetidos à IRR por indução cirúrgica e receberam a terapia celular, nos quais foram divididos em três grupos: Controle (GC), tratamento com CTM (GE1) e com CPR (GE2). Foram coletados fragmentos de tecido renal mediante biópsias seriadas, dia 4 e 8, para análise da proliferação celular, apoptose e a angiogênese por imunoistoquímica, avaliação do dano ao DNA pelo ensaio de cometa, e o estresse oxidativo pela mensuração dos níveis de peroxidação lipídica (TBARS), nitrito e atividade dos sistemas antioxidantes (glutationa reduzida-GSH e catalase). A estatística dos dados obtidos foi realizada por meio da Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste de Tuckey e Neuman-Keuls. Na caracterização imunofenotípica de CTM observou-se marcação CD14-, CD24-, CD133-, CD105+, CD90+, CD106+ e CD140b+ e para CPR obteve-se marcação CD14-, CD24-, CD133+, CD105+, CD90+, CD106+ e CD140b+. A curva de viabilidade celular se estendeu até o dia 15 para CPR e dia 21 para CTM. As duas linhagens apresentaram a passagem inicial com alto nível de apoptose e baixo de necrose, com inversão na passagem terapêutica, e altos níveis na tardia. A passagem precoce de CTM e CPR indicou menor índice de danos do que a fase terapêutica e tardia. As passagens de CPR expressaram baixos níveis de peroxidação lipídica e nitrito quando comparada a CTM, e atividade de enzimas antioxidantes preservadas durante o cultivo para as duas linhagens. No ensaio in situ, foi verificado que os fragmentos de tecido do GC, GE1 e GE2 apresentaram marcação semelhante para proliferação celular nos túbulos renais, diferindo apenas em relação às células glomerulares no dia 4 e intersticiais (p<0,05) no GE1. Já, quanto à marcação para células apoptóticas o GC obteve maiores níveis que o GE1 e o GE2, exceto no dia 8 do GE1. A expressão da angiogênese não demonstrou diferença estatística significativa entre os grupos, no interstício e túbulos renais. No entanto, nos glomérulos e nos vasos peritubulares, a expressão do marcador prevaleceu no GE2. Na análise do estresse oxidativo, o G1 se destacou, com altos níveis de TBARS e nitrito, com baixa atividade das enzimas antioxidantes (p<0,05). Ainda, quanto aos danos ao DNA, nos animais do GE1 apresentaram maior frequência e índice comparados aos do GC negativo e GE2, com uma redução durante os dias no GE2. Com base nos achados desta pesquisa, as células-tronco mesequimais e progenitoras renais apresentaram-se satisfatórias na passagem precoce in vitro e com melhores resultados na regeneração renal in situ quando comparados aos suínos não tratados. Ademais, referentemente ao estresse oxidativo e ao dano ao DNA, os ensaios com células progenitoras renais, demonstraram maior eficácia.

ABSTRACT: Therapy with mesenchymal stem cells (MSC) and renal progenitor cells (RPC) has shown increasing interest because of their potential regenerative and immunosuppressive capacity in various nephropathies, including renal ischemia-reperfusion injury (IRI). However, for the clinical application of these cells there must be extensive safety with studies aimed at maintaining the conditions of culture during its expansion and with observance in experimental clinical trials. The objective of this study was to evaluate oxidative stress and DNA damage in situ and in vitro, cell proliferation and apoptosis, and angiogenesis, in the treatment of kidney injury in pigs. MSC of the bone marrow and CPR of the renal cortex of pigs were used using early, therapeutic and late passages to analyze the culture during the expansion. For in situ evaluation, 15 pigs were submitted to IRI by surgical induction and received cell therapy, in which they were divided into three groups: Control (GC), treatment with MSC (GE1) and RPC (GE2). Renal tissue fragments were collected by serial biopsies for analysis of cell proliferation, apoptosis and angiogenesis by immunohistochemistry, evaluation of DNA damage by the comet assay, and oxidative stress by measuring levels of lipid peroxidation (TBARS), nitrite and activity of antioxidant enzymes (reduced glutatione-GSH and catalase). The statistical analysis of the data was performed using the Analysis of Variance (ANOVA) followed by the Tuckey and Neuman-Keuls test. In the immunophenotypic characterization of MSC, the CD14-, CD24-, CD133-, CD905 +, CD90 +, CD106 + and CD140b + markers were observed, and CD14-, CD24-, CD133 +, CD155 +, CD90 +, CD106 + and CD140b + were obtained for RPC. The cell viability curve was extended up to day 15 for RPC and day 21 for MSC. Both lines presented the initial passage with high level of apoptosis and low necrosis, with inversion in the therapeutic passage, and high levels in the late one. The early passage of MSC and RPC indicated a lower rate of damage than the therapeutic and late phase. The RPC passages expressed low levels of lipid peroxidation and nitrite when compared to MSC, and activity of antioxidant enzymes preserved during cultivation for both strains. In the in situ assay, CG, GE1 and GE2 animals showed similar marking for cell proliferation in the renal tubules, differing only in day 4 and interstitial glomerular cells (p <0.05) in GE1. Already, regarding the measurement of apoptotic cells the GC obtained higher levels than GE1 and GE2, except on day 8 of GE1. The expression of angiogenesis did not show a significant statistical difference between the groups in the interstitium and renal tubules; however, in the glomeruli and in the peritubular vessels, the expression of the marker prevailed in GE2. In the analysis of oxidative stress, G1 stood out, with high levels of TBARS and nitrite with low activity of antioxidant enzymes (p <0.05). Also, for DNA damage, in GE1 animals presented higher frequency and index compared to GC negative and GE2, with a reduction during the days in GE2. Based on the findings of this research, the mesequimal and renal progenitor stem cells were satisfactory at the early passage in vitro and with better results in renal regeneration in situ when compared to the untreated pigs. In addition, to oxidative stress and DNA damage, r enal progenitor cell assays have been shown to be more effective.