ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ADIPODERIVADAS DE SUINOS

Abstract

RESUMO: As células-tronco adipoderivadas (ADSC) constituem-se numa subpopulação de células-tronco mesenquimais amplamente estudadas, dada a facilidade de obtenção de tecido adiposo subcutâneo, em humanos e animais, para isolamento celular. Diversos protocolos de cultivo celular tem sido descritos na literatura especializada, com grande variabilidade dos dados de clonogenicidade, cinética celular e viabilidade, denotando a necessidade de reprodutibilidade e padronização das técnicas de cultivo e ensaios in vitro. Asim, este trabalho tem como objetivo caracterizar as ADSC suínas, por meio de método enzimático utilizando apenas 1 grama de tecido subcutâneo, empregando 4 ensaios in vitro fundamentais. Para tanto, a coleta de tecido adiposo foi realizada em dois porcos hígidos, com idade entre 70-90 dias, oriundos do criatório de suínos do setor de Zootecnia da Universidade Federal do Piauí. O material foi dissociado mecanicamente em uma placa de petri, sendo adicionado colagenase do tipo I para digestão enzimática, incubado em estufa úmida a 37ºC com 5% de CO 2 e 95% de umidade durante 30 minutos. A reação enzimática foi neutralizada pela adição de meio de cultura basal completo alpha-MEM a 37ºC, suplementado. As culturas foram expandidas em garrafas de 25cm 2 até a 3 passagem, fotografadas em microscópio invertido. Após o estabelecimento da cultura, foi realizada a avaliação da morfologia celular, ensaio de unidade formadora de colônia, cinética celular utilizando azul de Trypan e MTT, plasticidade e caracterização imunofenotípica. O processo de isolamento das CTMA demonstrou em todas as amostras adesão à superfície plástica e morfologia celular variando de fusiforme a fibroblastoíde, núcleos esféricos e proliferação em monocamada, comprimento médio de 46,34 ± 13,50µm e largura média de 7,61 ± 1,23µm. No ensaio de UFC foi possível observar a formação de 187 colônias bem definidas. Na curva de crescimento com Trypan as células apresentaram concentração média de 1,69 ± 1 x 10 5 células por poço cultivado e viabilidade média de 90,94 ± 0,05%, exibindo as fases LAG, LOG, PLATEAU e DECLÍNIO. Quanto ao MTT demonstraram absorbância média de 2,39 ± 0,72, apresentando as fases LAG, LOG e DECLÍNIO, não sendo observada fase PLATEAU. As CTMA apresentaram diferenciação nas três linhagens, adipogênica, osteogênica e condrogênica. Quanto à caracterização por citometria de fluxo expressaram CD14-/CD90+/CD105+. Conclui-se que, o tecido adiposo de suíno apresenta uma população distinta de células-tronco mesenquimais capaz de manter-se em expansão contínua, em cultivo, originando três linhagens celulares mesodermais distintas e expressando os marcadores específicos, o que demonstra a eficácia do método. ABSTRACT: Adipoderivated stem cells (ADSC) are a subpopulation of mesenchymal stem cells widely studied, given the ease of obtaining subcutaneous adipose tissue, in humans and animals, for cell isolation. Several cell culture protocols have been described in the specialized literature, with great variability of data on clonogenicity, cell kinetics and viability, denoting the need for reproducibility and standardization of culture techniques and in vitro tests. For this reason, this work aims to describe the characterization of swine ADSC, by means of an enzymatic method using only 1 gram of subcutaneous tissue, using 4 fundamental in vitro assays. Therefore, the collection of adipose tissue was carried out in two healthy pigs, aged between 70 and 90 days, being the pig breeding base of the Animal Science sector of the Federal University of Piauí. The material was mechanically dissociated into a petri dish, added to a type I mixture for enzymatic digestion, incubated in an oven at 37ºC with 5% CO2 and 95% humidity for 30 minutes. The enzyme was neutralized by the addition of basal culture medium alpha-MEM at 37ºC, supplemented. The waves were expanded in bottles of 25cm 2 to 3 passages, photographed under inverted microscope. After the establishment of the culture, a cellular morphological evaluation, colony elution assay, cell kinetics using Trypan blue and MTT, plasticity and immunophenotypic characterization were performed. The ADSC Isolation Process demonstrated in all the adhesion samples the plastic surface and cellular morphology of a fusiform fibroblast, spherical nuclei and monolayer proliferation, mean length of 46.34±13.50μm and Mean Width of 7.61±1,23μm. No reaction from the CFU was able to observe a formation of 187 well-defined colonies. In the growth curve based on the mean of 1.69±1x10 5 cells per well cultivated and mean path of 90.94 ± 0.05%, displaying as phases LAG, LOG, PLATEAU and DECLINE. As for MTT, they showed an average absorption of 2.39±0.72, presenting LAG, LOG and DECLINE phases, not being followed by the PLATEAU phase. As ADSC, the differentiation in the three strains, adipogenic, osteogenic and chondrogenic. Regarding the characterization by flow cytometry they expressed CD14- / CD90 + / CD105 +. It is concluded that the pig adipose tissue presents a distinct population of mesenchymal stem cells able to keep expanding, in culture, originating three distinct mesoderm cell lines and expressing the specific silhouettes, which demonstrates an action of the method.