PERFIL QUÍMICO, TOXICIDADE, EFEITO ANTI-HIPERTENSIVO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS PARTES AÉREAS DE Phyllanthus amarus Schumach. & Thonn. (QUEBRA-PEDRA) ASSOCIADAS AO CLORETO DE MAGNÉSIO

Abstract

RESUMO A espécie Phyllanthus amarus, popularmente conhecida como quebra-pedra, tem sido pesquisada devido aos benefícios encontrados em substâncias bioativas presentes nesta espécie, como atividade antioxidante, anti-hiperglicêmica, hepatoprotetora, cardioprotetora e antimicrobiana. O magnésio desempenha importantes funções intracelulares, além de regular o tônus vascular e a função endotelial. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o perfil químico, citotoxicidade, toxicidade aguda, atividade hipotensora, anti-hipertensiva e antimicrobiana do extrato etanólico obtido das partes aéreas de Phyllanthus amarus (PAE), cloreto de magnésio (MgCl2) ou de um composto formado a partir de PAE e MgCl2, na forma de extrato (PAE+MgCl2) ou Chá (PAE+MgCl2 3%). O perfil químico do PAE foi analisado por cromatografia gasosa com espectrometria de massas. No estudo de toxicidade aguda os ratos foram tratados com dose oral única de 2000 mg/kg/animal e a citotoxicidade foi avaliada pelo teste do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-zil)-2-5-difeniltetrazolio (MTT). Para avaliar os parâmetros cardiovasculares, foram utilizados modelos de ratos normotensos e hipertensos L-NAME (NG-nitro-L-arginina-metil éster) a partir da técnica da medida direta da pressão arterial e frequência cardíaca em ratos acordados. Além disso, investigou-se os possíveis mecanismos de ação envolvidos na resposta anti-hipertensiva do extrato etanólico de P. amaus associado ao cloreto de magnésio (PAE+MgCl2). Testes de microdiluição foram realizados para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) do PAE ou Filantina para diferentes espécies de microrganismos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans). Para avaliar se o PAE ou Filantina foram capazes de agir como moduladores da resistência às fluoroquinolonas, a CIM para Norfloxacina e brometo de etídio foram determinados na presença ou ausência de PAE ou Filantina contra S. aureus SA1199-B, em concentrações subinibitórias. A análise química do PAE apresentou em sua composição as lignanas: Nirantina, Hipofilantina, Nirtetralina, Filantina, Filtetralina, Lignana D e Lignana 370. Nos estudos de viabilidade celular a porcentagem de células viáveis diminuiu a partir de 400 e 100 µg/mL para o PAE e PAE+MgCl2, respectivamente, apresentando CC50 iguais 196 e 50 µg/mL, para as respectivas substâncias. Os testes farmacológicos com dose única de 2000 mg/kg de PAE, MgCl2 ou PAE+MgCl2 não causou morte nos animais e não produziu alterações bioquímicas em parâmetros hepáticos ou renais. Em relação à resposta sobre o sistema cardiovascular, o PAE+MgCl2 administrado por via endovenosa nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, promoveu efeito hipotensor dose-dependente em ratos normotensos (ΔPAM= -15,57 ± 2,84*; -40,03 ± 5,97* e -85,49 ± 4,26* mmHg, respectivamente) e efeito anti-hipertensivo dose-dependente, em animais hipertensos (ΔPAM= -31,65 ± 4,57*; -68,19 ± 7,12* e -97,26 ± 8,42* mmHg, respectivamente), ambos associados à bradicardia. Após tratamento agudo com atropina, hexametônio, ioimbina e propranolol, os efeitos anti-hipertensivo e bradicárdico de PAE+MgCl2 foram significativamente atenuados, sugerindo o envolvimento de receptores muscarínicos, α2 e β-adrenérgicos na resposta anti-hipertensiva. O tratamento por via oral com PAE+MgCl2, por 7 dias na dose de 300 mg/kg/dia em animais L-NAME, promoveu diminuição significativa na pressão arterial média (PAM), a partir de 180 minutos após a administração da dose (ΔPAM= -21,40 ± 4,89* mmHg), permanecendo reduzida até 270 minutos (ΔPAM= -24,17 ± 5,36* mmHg). O Chá PAE+MgCl2 (3%) promoveu efeito anti-hipertensivo, quando administrado por via oral durante 7 dias (ΔPAM= -32,28 ± 7,52* mmHg) ou quando administrado agudamente (ΔPAM= -29,81 ± 5,35* mmHg), apresentando uma diminuição na PAM 240 ou 180 minutos após a gavagem do Chá PAE+MgCl2 (3%), respectivamente, sem alterações na frequência cardíaca. O PAE mostrou atividade antimicrobiana contra cepas Gram-negativas, enquanto a Filantina foi inativa contra todas as cepas testadas. O PAE ou a Filantina, em concentrações subinibitórias, aumentou a atividade da norfloxacina contra linhagem de S. aureus que superexpressa o gene NorA, sugerindo que os produtos naturais testados podem potencializar a ação deste antibiótico. Este estudo sugere que o PAE associado ao cloreto de magnésio induz efeito hipotensor e anti-hipertensivo, provavelmente por atuação em receptores muscarínicos inespecíficos, receptores nicotínicos ganglionares e receptores α2-adrenérgicos. Além disso, a filantina e o PAE podem ser utilizados como um agente potencializador da atividade da norfloxacina no tratamento de infecções causadas por S. aureus resistente a fluoroquinolonas. ABSTRACT: Phyllanthus amarus, popularly known as rock breaker, has been researched due to the benefits found in bioactive substances present in this species, such as antioxidant, antihyperglycemic, hepatoprotective, cardioprotective and antimicrobial activity. Magnesium performs important intracellular functions in addition to regulating vascular tone and endothelial function. The aim of this research was to evaluate the chemical profile, cytotoxicity, acute toxicity, hypotensive, antihypertensive, and antimicrobial activity of the ethanolic extract obtained from Phyllanthus amarus (PAE), magnesium chloride (MgCl2) or a compound formed from PAE and MgCl2 as extract (PAE+MgCl2) or Tea (PAE+MgCl2 3%). The PAE chemical profile was analyzed by gas chromatography with mass spectrometry. In the acute toxicity study rats were treated with a single oral dose of 2000 mg/kg/animal and cytotoxicity was assessed by the 3-(4,5-dimethylthiazol-zyl) -2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test. To evaluate cardiovascular parameters, we used normotensive and hypertensive rat models L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester) using the technique of direct measurement of blood pressure and heart rate in awake rats. Furthermore, we investigated the possible mechanisms of action involved in the antihypertensive response of P. amaus ethanolic extract associated with magnesium chloride (PA+MgCl2). Microdilution tests were performed to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of PAE or Phyllanthin for different species of microorganisms (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans). To assess whether PAE or Phyllanthin were able to act as fluoroquinolone resistance modulators, the MIC for Norfloxacin and ethidium bromide were determined in the presence or absence of PAE or Phyllanthin against S. aureus SA1199-B at subinhibitory concentrations. The chemical analysis of PAE presented in its composition the lignans: Niranthine, Hypophyllanthin, Nirtetraline, Phyllanthin, Filtetraline, Lignana D and Lignana 370. In the cell viability studies the percentage of viable cells decreased from 400 and 100 µg/mL for the PAE and PAE+MgCl2, respectively, with CC50 equal to 196 and 50 µg/mL, for the respective substances. Pharmacological tests with a single dose of 2000 mg/kg PAE, MgCl2 or PAE+MgCl2 did not cause death in animals and did not produce biochemical changes in hepatic or renal parameters. Regarding the response on the cardiovascular system, intravenously administered PAE+MgCl2 at doses of 25, 50 and 100 mg/kg promoted a dose-dependent hypotensive effect in normotensive rats (ΔPAM = -15.57 ± 2.84*). -40.03 ± 5.97* and -85.49 ± 4.26* mmHg, respectively) and dose-dependent antihypertensive effect in hypertensive animals (ΔPAM = -31.65 ± 4.57*; - 68.19 ± 7.12* and -97.26 ± 8.42* mmHg, respectively), both associated with bradycardia. After acute treatment with atropine, hexamethonium, yohimbine and propranolol, the antihypertensive and bradycardic effects of PAE+MgCl2 were significantly attenuated, suggesting the involvement of muscarinic, α2 and β-adrenergic receptors in the antihypertensive response. Oral treatment with PAE+MgCl2 for 7 days at a dose of 300 mg/kg/day in L-NAME animals led to a significant decrease in mean arterial pressure (MAP) from 180 minutes after dosing (ΔPAM = -21.40 ± 4.89* mmHg), remaining reduced up to 270 minutes (ΔPAM = -24.17 ± 5.36* mmHg). PAE + MgCl2 Tea (3%) promoted antihypertensive effect when administered orally for 7 days (ΔPAM = -32.28 ± 7.52* mmHg) or when acutely administered (ΔPAM = -29.81 ± 5 , 35* mmHg), showing a decrease in MAP 240 or 180 minutes after the storage of PAE+MgCl2 tea (3%), respectively, without changes in heart rate. PAE showed antimicrobial activity against Gram-negative strains, while Phyllanthin was inactive against all strains tested. PAE or Phyllanthin, at subinhibitory concentrations, increased norfloxacin activity against S. aureus strain that overexpresses the NorA gene, suggesting that the natural products tested may potentiate the action of this antibiotic. This study suggests that magnesium chloride-associated PAE induces hypotensive and antihypertensive effects, probably by acting on non-specific muscarinic receptors, ganglionic nicotinic receptors and α2-adrenergic receptors. In addition, Phyllanthin and PAE may be used as a potentiating agent of norfloxacin activity in the treatment of infections caused by fluoroquinolone resistant S. aureus.