CRIOPRESERVAÇÃO LENTA E VITRIFICAÇÃO DE OÓCITOS OVINOS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

Abstract

Objetivou-se avaliar a viabilidade de oócitos ovinos imaturos submetidos à congelação lenta e vitrificação na produção in vitro de embriões partenogenéticos. Para tanto, foram colhidos 394 ovários oriundos de 197 ovelhas púberes, provenientes de abatedouros localizados no município de Teresina, PI. Os ovários foram transportados para o laboratório em garrafa térmica, contendo solução salina fisiológica a 37 °C acrescida de 40mg/mL de sulfato de gentamicina. Os ovários foram aspirados utilizando-se um aspirador cirúrgico adaptado, contendo na extremidade de aspiração uma agulha 21G. Foram recuperados 616 CCO‘s, obtendo-se uma taxa de recuperação de 3,13 CCO’s por par de ovários. Após seleção e classificação, os CCO’s foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais, oócitos destinado a congelação lenta, oócitos destinado a vitrificação e oócitos do grupo controle. Em seguida os CCO’s foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta e vitrificação. Após o período mínimo de 30 dias, os oócitos da congelação lenta e vitrificação foram descongelados. Um grupo aleatório de oócitos oriundos da congelação lenta foi submetido ao teste do Azul Cresil Brilhante (ACB). 10% dos oócitos criopreservados foram submetidos à análise através da associação de sondas fluorescentes (iodeto de propídio e diacetato de carboxifluresceína). Ulteriormente, os oócitos oriundos da vitrificação e da congelação lenta, inclusive os que haviam sido avaliados no teste do ACB, foram submetidos à maturação in vitro (MIV). Após 24 horas de MIV, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Seguidamente, às 28 horas após MIV, os oócitos foram submetidos à ativação partenogenética. Ao término da ativação, com 32 horas, os oócitos foram submetidos ao cultivo in vitro (CIV) durante oito dias. As estruturas em CIV foram avaliadas no D2, D7 e D8. No último dia de CIV, realizou-se a coloração das estruturas com Hoechts 33342. Neste estudo, observou-se que o grupo controle (oócitos frescos) apresentou melhor desempenho nas etapas de produção in vitro de embriões, apresentando um maior número de oócitos maturados in vitro (47,5%), havendo clivagem no D2 e desenvolvimento embrionário até a fase de mórula, a qual foi evidenciada no D7 e D8 do cultivo in vitro (P=0,008). Entretanto, os oócitos oriundos dos grupos congelação lenta e vitrificação, não apresentaram competência de desenvolvimento embrionário in vitro (P=0,008). Na análise de sondas fluorescentes o grupo de oócitos da congelação lenta demonstrou integridade de membrana, enquanto que no grupo de vitrificados houve oócitos com membrana íntegra e lesionada (P = 0,280). No teste do ACB houve relação positiva dos oócitos oriundos da congelação lenta em relação à taxa de maturação in vitro (P = 0,001). Após criopreservação, os oócitos ovinos imaturos alcançaram a maturação in vitro, no entanto, não progrediram no desenvolvimento embrionário. Dessa forma, sendo relevante a realização de mais pesquisas voltadas às técnicas de congelação lenta e vitrificação de oócitos ovinos, a fim de produzir embriões in vitro. ABSTRACT: The objective of this study was to evaluate the viability of immature sheep oocytes submitted to slow freezing and vitrification in vitro production of parthenogenetic embryos. To this end, 394 ovaries from 197 pubescent ewes were collected from slaughterhouses located in Teresina, PI. The ovaries were transported to the laboratory in a thermal bottle containing physiological saline solution at 37 ° C plus 40 mg / mL of gentamicin sulfate The ovaries were aspirated using an adapted surgical aspirator, containing at the suction end a 21G needle. 616 CCO's were recovered, obtaining a recovery rate of 3.13 CCO's per ovarian pair After selection and classification, the CCOs were randomly divided into three experimental groups, oocytes for slow freezing, oocytes for vitrification and oocytes of the control group. Then the CCO's were stripped and then subjected to slow freezing and vitrification. After the minimum period of 30 days, the oocytes from slow freezing and vitrification were thawed. A random group of oocytes from slow freezing was subjected to the Brilliant Cresyl Blue (CBA) test. 10% of the cryopreserved oocytes were submitted to analysis by the association of fluorescent probes (propidium iodide and carboxyphureuretic diacetate. Later, oocytes from vitrification and slow freezing, including those that had been evaluated in the CBA test, were subjected to in vitro maturation (IVM). After 24 hours of IVM, the nuclear maturation was evaluated. Then, at 28 hours after IVM, the oocytes were submitted to parthenogenetic activation. At the end of the activation, at 32 hours, the oocytes were submitted to in vitro culture (IVC) for eight days. The structures in IVC were evaluated in D2, D7 and D8. On the last day of IVC, staining of the structures was performed with Hoechts 33342 In this study, it was observed that the control group (fresh oocytes) presented better performance in the in vitro embryo production stages, presenting a greater number of oocytes matured in vitro (47.5%), with D2 cleavage and embryo development until the morula phase, which was evidenced in D7 and D8 of the in vitro culture (P = 0.008). However, oocytes from the slow freezing and vitrification groups did not present in vitro embryo development competence (P = 0.008). In the fluorescence probes analysis, the oocytes from slow freezing demonstrated membrane integrity, while in the vitrified group there were oocytes with intact and diseased membrane (P = 0.280 In the CBA test there was a positive relation of the oocytes from slow freezing to the in vitro maturation rate (P = 0.001. After cryopreservation, immature ovine oocytes reached maturation in vitro, however, they did not progress in the embryonic development. Therefore, it is relevant to carry out more research on the techniques of slow freezing and vitrification of ovine oocytes in order to produce embryos in vitro