POTENCIALIDADES FARMACOLÓGICAS DE RIPARINAS SINTÉTICAS COMO AGENTES ANTIMICROBIANOS

Abstract

RESUMO: A pesquisa de novos antimicrobianos faz-se necessária devido ao surgimento de cepas multirresistentes, incluindo micro-organismos que não possuem sensibilidade a nenhum dos fármacos disponíveis. Além disso, as leishmanioses possuem alta endemicidade no Brasil. Entretanto, os medicamentos disponíveis possuem graves limitações, por toxicidade e alto custo, além da via de administração ser parenteral. Outro aspecto relevante é a baixa taxa de lançamento de novos agentes, por esse motivo, é urgente que pesquisas sejam realizadas para desenvolvimento de novos antimicrobianos. Nesse contexto, as riparinas são moléculas promissoras, pois há relatos na literatura da atividade de alguns dos análogos sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Schistosoma mansoni. Dessa forma, com este trabalho objetivou-se investigar o potencial das riparinas no combate a doenças infecciosas. Para isso, primeiramente foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) das riparinas A, B, C, D e E contra S. aureus e foi avaliado seu potencial modulador no co-tratamento com ciprofloxacino e norfloxacino. Rip-E foi a que apresentou maior atividade intrínseca (CIM = 32 μg/mL) e, Rip-B foi a com maior atividade moduladora. Rip-B teve seu mecanismo de modulação da resistência investigado por ensaios de efluxo com brometo de etídio, no qual reduziu o CIM do brometo de etídio no co-tratamento, sugerindo inibição do efluxo. Esse mecanismo confirmado por ancoragem, onde Rip-B foi a molécula com mais provável encaixe com a bomba NorA de S. aureus. A partir da determinação do CIM de S. aureus, a riparina com maior atividade antimicrobiana intrínseca teve seu CIM avaliado para outras cepas de bactérias Gram positivas (S. aureus and S. epidermidis) e Gram negativas (E. coli, Salmonella Typhimurium e Pseudomonas aeruginosa), leveduras (Candida albicans e C. tropicalis). As cepas tratadas com Rip-E foram analisadas por citometria de fluxo com 7-AAD para determinar se a atividade antimicrobiana da Rip-E está relacionada com lesão à membrana celular. Os testes de microdiluição mostraram que a riparina A não apresentou atividade antibacteriana significativa contra todas as cepas testadas. Por outro lado, a riparina E foi ativa contra as espécies Gram-positivas e Gram-negativas (exceto P. aeruginosa), e também apresentou atividade contra as duas espécies de leveduras testadas. O efeito inibitório apresentado pela riparina E foi microbicida para todas as cepas testadas. Análises de citometria de fluxo com as cepas tratadas com riparina E na presença do corante 7-AAD indicaram que a atividade antibacteriana e antifúngica da riparina E são decorrentes da lesão à membrana citoplasmática. Os resultados obtidos neste estudo apontam para a possibilidade do uso da riparina E como agente microbicida na prevenção ou no tratamento de doenças infecciosas. Em relação à atividade antileishmania, a riparina E possui um bom potencial no combate a L. amazonensis e demonstrou redução na infecção em concentrações mais baixas, nas quais não apresentou toxicidade in vitro aos macrófagos. Além disso, promoveu a ativação dos macrófagos por aumento da fagocitose e aumento da atividade lisossomal, porém sem interferir na liberação de óxido nítrico. Diante desses resultados pode-se concluir que as riparinas possuem um grande potencial antimicrobiano para tratamento de doenças infecciosas ou em co-tratamento associadas à ciprofloxacino e norfloxacino, além de a riparina E apresentar bom potencial para tratamento da leishmaniose cutânea.

ABSTRACT: Research into new antimicrobials is necessary because of the emergence of multi-resistant antimicrobial strains, including microorganisms that have no sensitivity to any of the available drugs. In addition, diseases caused by Leishmania are highly endemic in Brazil. However, the antileishmanial drugs have serious limitations due to toxicity, high cost and the route of administration (parenteral). Another relevant aspect is the rate of release of new drugs, therefore, it is urgent for the development of new antimicrobials. In this context, riparins are promising molecules, there are some reports in the literature on the activity of some of its analogues on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Schistosoma mansoni. Thus, this work aimed to investigate the potential of riparins of fighting infectious diseases. For this, the minimum inhibitory concentration (MIC) of riparins A, B, C, D and E against S. aureus was determined and their modulatory potential was evaluated in the co-treatment with ciprofloxacin and norfloxacin. Rip-E presented the best intrinsic activity (MIC = 32 μg / mL) and Rip-B presented the highest modulating activity. Rip-B had its mechanism of resistance modulation investigated by ethidium bromide efflux trials, in which it reduced the MIC of ethidium bromide at co-treatment, suggesting inhibition of efflux. This mechanism confirmed by molecular docking, in which Rip-B was the most likely molecule to fit with the NorA pump of S. aureus. From the determination of MIC for S. aureus, the riparin with the highest intrinsic antimicrobial activity had its MIC evaluated for other strains of Gram positive (S. aureus and S. epidermidis) and Gram negative bacteria (E. coli, Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa) and yeasts (Candida albicans and C. tropicalis). The Rip-E treated samples were then analyzed by flow cytometry with 7-AAD staining to determine whether Rip-E's antimicrobial activity is related to cell membrane damage. Microdilution tests showed that riparin A showed no significant antibacterial activity against all strains tested. On the other hand, riparin E was active against Gram-positive and Gram-negative species (except P. aeruginosa), and also presented activity against the two species of yeasts tested. Riparin E was microbicidal for all strains tested. Flow cytometric analysis with strains treated with riparin E in the presence of 7-AAD dye indicated that the antibacterial and antifungal activity of riparin E are due to cytoplasmic membrane injury. The results obtained in this study point to the possibility of using riparine E as a microbicidal agent in the prevention or treatment of infectious diseases. Regarding the antileishmania activity, the riparin E presented a good activity against the two evolutionary forms of L. amazonensis and demonstrated a reduction in the infection in lower concentrations, in which Rip-E did not present toxicity in vitro to the macrophages. In addition, Rip-E promoted the activation of macrophages by increased phagocytosis and increased lysosomal activity, but without interfering with the release of nitric oxide. Therefore, it can be concluded that riparins have a great antimicrobial potential for the treatment of infectious diseases, alone or in combination with ciprofloxacin and norfloxacin. Besides, riparine E also presents good potential for treatment of cutaneous leishmaniasis.