POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DA FRAÇÃO AQUOSA DO EXTRATO ETANÓLICO DE Terminalia fagifolia Mart. E IDENTIFICAÇÃO DO SEU CONSTITUINTE MAJORITÁRIO

Abstract

RESUMO:A espécie Terminalia fagifolia Mart., presente no cerrado brasileiro, se destaca pelo seu uso etnofarmacológico. Em estudos anteriores, a fração aquosa do extrato etanólico de T. fagifolia apresentou resultados promissores no tocante à atividade antibacteriana, antibiofilme, citotóxica, antiulcerogênica e vasorrelaxante, sendo a fração do extrato etanólico mais ativa dentre aquelas testadas. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi averiguar o potencial biotecnológico da fração aquosa do extrato etanólico de T. fagifolia Mart., bem como isolar e identificar seu constituinte majoritário. A fração aquosa foi avaliada quanto ao seu potencial antifúngico contra leveduras e fungos filamentosos, de acordo com os documentos M27-A3 e M38-A2 da CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute (2008), com posterior análise das alterações morfológicas em Candida albicans por microscopia de força atômica. O potencial anti-inflamatório da fração aquosa foi verificado por meio dos modelos de edema de pata e peritonite induzidos por carragenina em camundongos, além do modelo de neuroinflamação induzida por lipopolissacarídeo em células microgliais. A atividade antioxidante da fração aquosa foi caracterizada por ensaios in vitro, tais como sequestro dos radicais DPPH, ABTS, além da capacidade de redução do ferro (FRAP) e de absorção do radical oxigênio (ORAC). A toxicidade da fração aquosa foi testada em eritrócitos humanos e em larvas de Galleria mellonella. Para identificação do constituinte majoritário, o estudo fitoquímico da fração aquosa foi realizado por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear. As características do mecanismo de ativação da molécula foram estudadas usando simulações computacionais de química quântica. O extrato etanólico e a fração aquosa de T. fagifolia foram utilizados para síntese verde de nanopartículas de prata (AgNPs), que foram caracterizadas por espectroscopia do ultra-violeta ao visível, infra-vermelho com transformada de Fourier, análise de rastreamento de nanopartículas, microscopia eletrônica de transmissão acoplada a espectroscopia por dispersão de energia e voltametria cíclica. Uma vez caracterizadas, as AgNPs foram testadas quanto a sua atividade antioxidante (DPPH, ABTS, FRAP e ORAC), com determinação de fenólicos e flavonoides totais, além da sua atividade antibacteriana e antifúngica. O teste de hemólise foi realizado para verificar a atividade hemolítica das AgNPs. Após a realização dos testes, a fração aquosa demonstrou excelente potencial antifúngico, principalmente contra leveduras sensíveis e resistentes do gênero Candida sp.. Em relação aos modelos murinos utilizados, a fração aquosa diminuiu significativamente (p<0.05) o edema de pata na terceira hora, com percentual de inibição do processo inflamatório semelhante ao da Indometacina, além disso, reduziu significativamente (p<0.05) os níveis de malondialdeído no modelo de peritonite. Em micróglias, o pré-tratamento com a fração aquosa foi capaz de inibir significativamente a produção de fator nuclear kappa B após indução com lipopolissacarídeo. Quanto aos ensaios de toxicidade, a fração aquosa não demonstrou toxicidade contra as larvasde G. mellonella e não diminuiu a viabilidade dos eritrócitos, nas concentrações ≤ 500 µg/mL. A partir das análises fitoquímicas, identificou-se um derivado do ácido elágico, eschweilenol C, como o constituinte majoritário da fração aquosa. Os estudos teóricos mostraram semelhança estrutural entre a molécula isolada e a indometacina, além de um excelente potencial antioxidante. Com o extrato etanólico e a fração aquosa foi possível sintetizar nanopartículas de prata esféricas e poligonais, respectivamente e as AgNPs sintetizadas apresentaram atividade antimicrobiana e potencial antioxidante. Os resultados obtidos nessa investigação indicam que a fração aquosa do extrato etanólico tem potencial para aplicação na área biomédica, com baixa toxicidade. Com a fração aquosa rica em metabólitos secundários foi possível reduzir e estabilizar a prata, resultando em nanopartículas de prata bioativas. ABSTRACT:The species Terminalia fagifolia Mart., present in the Brazilian cerrado, stands out for its ethnopharmacological use. In previous studies, the aqueous fraction of the ethanolic extract of T. fagifolia showed promising results regarding the antibacterial, antibiofilm and cytotoxic activities, being the fraction of the ethanolic extract more active among those tested. Thus, the objective of this study was to investigate the biotechnological potential of the aqueous fraction of the ethanolic extract of T. fagifolia Mart., as well as to isolate and identify its major compound. The aqueous fraction was evaluated for its antifungal potential against yeasts and filamentous fungi, according to the documents M27-A3 and M38-A2 of CLSI (2008), with subsequent analysis of the morphological alterations in Candida albicans by atomic force microscopy. The anti-inflammatory potential of the aqueous fraction was verified by carrageenan-induced paw edema and peritonitis models in mice, in addition to the model of LPS-induced neuroinflammation in microglial cells. The antioxidant activity of the aqueous fraction was characterized by in vitro assays, such as sequestration of DPPH, ABTS radicals, in besides iron reduction capacity (FRAP) and ORAC value. Toxicity of the aqueous fraction was tested on human erythrocytes and Galleria mellonella larvae. For the identification of the major constituent, the phytochemical study of the aqueous fraction was performed using HPLC, LC-MS and NMR. Further insights on the activation mechanism were studied using quantum chemistry computer simulations. The ethanolic extract and the aqueous fraction of T. fagifolia were used for green synthesis of silver nanoparticles (AgNPs), which were characterized by UV-vis spectroscopy, FTIR, NTA, TEM/EDS and cyclic voltammetry. Once characterized, the AgNPs were tested for their antioxidant activity (DPPH, ABTS, FRAP and ORAC), with determination of phenolics and total flavonoids, in addition to their antibacterial and antifungal activity. The haemolysis test was performed to verify the hemolytical activity of AgNPs. After the tests, the aqueous fraction showed excellent antifungal potential, especially against sensitive and resistant yeasts of the genus Candida sp.. In relation to the murine models used, the aqueous fraction significantly (p<0.05) decreased the paw edema in the third hour, with percentage of inhibition of the inflammatory process similar to Indomethacin, in addition, significantly (p<0.05) reduced the levels of malondialdehyde in the peritonitis model. In microglia, pretreatment with the aqueous fraction was able to significantly inhibit the production of NF-κB after induction with LPS. As for the toxicity tests, the aqueous fraction showed no toxicity against G. mellonella larvae and did not decrease the viability of erythrocytes at the concentrations ≤ 500 µg/mL. From the phytochemical analyzes, eschweilenol C, an ellagic acid derivative, was identified as the major constituent of the aqueous fraction. The theoretical studies showed structural similarity between isolated molecule and indomethacin, besides an excellent antioxidant potential. With the ethanolic extract and the aqueous fraction it was possible to synthesize spherical and polygonal silver nanoparticles, respectively, and the synthesized AgNPs presented antimicrobial activity and antioxidant potential. The resultsobtained in this investigation indicate that the aqueous fraction of ethanolic extract has potential for application in the biomedical area, with low toxicity. With the aqueous fraction rich in secondary metabolites it was possible to reduce and stabilize silver, resulting in bioactive silver nanoparticles.