IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Sugarcane yellow leaf virus E UM NOVO FITOPLASMA ASSOCIADOS À SÍNDROME DO AMARELECIMENTO FOLIAR EM CANA-DE-AÇÚCAR NO NORDESTE DO BRASIL

Abstract

RESUMO:A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância econômica e social para o Brasil, uma vez que é o principal produtor de açúcar e álcool. A cana-de-açúcar é acometida por doenças que afetam o seu rendimento e entre elas está a síndrome do amarelecimento da folha (SAF) ou amarelinho, doença que pode provocar perdas na produção de até 50%. São conhecidos dois agentes causais da SAF: Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) e Sugarcane yellow leaf phytoplasma (ScYLP). No Brasil, os únicos registros desses patógenos foram feitos em cana-de-açúcar na região Sudeste. Apesar dos estados do nordeste brasileiro serem importantes produtores de cana-de-açúcar, não é conhecida a presença desses patógenos. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi realizar a detecção e caracterização molecular de isolados de ScYLV e fitoplasma a partir de amostras foliares coletadas em regiões produtoras de cana-de-açúcar nos estados do Piauí, Ceará e Maranhão. Amostras de folhas de cana-de-açúcar com sintomas de amarelecimento foliar foram coletadas e tiveram seu DNA e RNA total extraído. As amostras foram submetidas a RT-PCR com oligonucleotídeos específicos correspondentes a parte do gene da capa proteica do ScYLV, e nested-PCR com oligonucleotídeos de sequências complementares à região 16S rDNA de fitoplasmas. Algumas amostras positivas tanto para ScYLV, quanto para fitoplasma foram sequenciadas e comparadas com sequências depositadas no GenBank. Árvores filogenéticas foram geradas utilizando os métodos de máxima verossimilhança e neighbor joining. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos do ScYLV detectados foram comparadas entre si e com sequências de isolados referência. Foram obtidos fragmentos de 450 pb específicos ao ScYLV para 40,49% (41/101) das amostras, enquanto que fragmentos de 210 pb para fitoplasmas foram amplificados em 62,24% (61/98) das amostras. O ScYLV e o fitoplasma foram detectados em todos os municípios amostrados. A incidência do ScYLV foi de 60,52% no município União-PI, 23,52% em São João dos Patos-MA, 17,85% em Sucupira do Riachão-MA e 50% em Viçosa-CE. A incidência do fitoplasma foi de 72,22% em União, 3,57% em Sucupira do Riachão e 100% em São João dos Patos e Viçosa. A comparação de identidade entre as sequências de nucleotídeos (nt) dos isolados de ScYLV variou de 99-100% e para aminoácidos a variação foi de 98-100%. Os isolados de ScYLV deste estudo agruparam no mesmo clado, juntamente com outros isolados brasileiros. Oito amostras de fitoplasma foram sequenciadas, e todas apresentaram 99% de identidade com Artemisia witches’-broom quando comparadas por BLASTn. Os oito isolados agruparam com outros fitoplasmas do grupo 16SrVII, com bootstrap de 81%. Este estudo identificou o ScYLV e um fitoplasma do grupo 16SrVII associados aos sintomas de SAF em plantas de cana-de-açúcar nos estados do Piauí, Ceará e Maranhão, além de revelar baixa variabilidade genética do gene da ORF3 do ScYLV. ABSTRACT:The sugarcane is a cultivated plant of great economic and social importance for Brazil, as it is the main source of sugar and alcohol production. Sugarcane may be affected by diseases that affect their yield, and, among them, is the yellow leaf syndrome (YLS) or yellowing, a disease that may cause production losses of up to 50%. Two causative agents of YLS are known: Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) and Sugarcane yellow leaf phytoplasma (ScYLP). In Brazil, the only recorded cases of these pathogens were made in sugarcane in the Southeast region. Although the states of northeastern Brazil are important producers of sugarcane, the presence of these pathogens is not known. Given the above, the objective of this study was to perform molecular detection and characterization of isolates of ScYLV and phytoplasma from leaf samples collected in sugarcane producing regions in the states of Piauí, Ceará and Maranhão. Samples of sugarcane with yellow leaf syndrome symptoms were collected and had their total DNA and RNA extracted. The samples were subjected to RT-PCR with specific oligonucleotides corresponding to part of the ScYLV protein coat gene, and to nested-PCR with oligonucleotides of complementary sequences to the 16S rDNA region of phytoplasmas, aiming to detect ScYLP. Some positive samples for both ScYLV and phytoplasma were sequenced and compared with sequences deposited in GenBank. The phylogenetic trees analysis were generated using the maximum likelihood and neighbor joining methods. The nucleotide and amino acid sequences of ScYLV detected were compared between each other and with reference isolate sequences. Fragments of 450 bp specific to ScYLV were obtained in 40.49% (41/101) of the samples, while fragments of 210 bp for phytoplasmas were an increased number, 62.24% (61/98) of samples. ScYLV and phytoplasma were detected in all sampled cities. The incidence of ScYLV was 60.52% in the city of União-PI, 23.52% in São João dos Patos-MA, 17.85% in Sucupira do Riachão-MA and 50% in Viçosa-CE. The incidence of phytoplasma was 72.22% in União, 3.57% in Sucupira do Riachão and 100% in São João dos Patos and Viçosa. The comparison of identity between the nucleotide sequences (nt) of ScYLV isolates varied from 99-100% and for amino acids the variation was of 98-100%. The ScYLV isolates from this study are grouped in the same clade, along with other Brazilian isolates. Eight phytoplasma samples were sequenced, and all showed 99% identity with Artemisia witches’-broom when compared to BLASTn. The eight isolates grouped with other phytoplasmas of the 16SrVII group, with bootstrap of 81%. This study identified ScYLV and a phytoplasma of the 16SrVII group associated with the symptoms of YLS in sugarcane plants in the states of Piauí, Ceará and Maranhã, as well as showing low variability of the ScYLV ORF3 gene.