IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA DE VÍRUS EM FEIJÃO-FAVA

Abstract

RESUMO:O feijão-fava (Phaseolus lunatus L.) é uma das principais leguminosas cultivadas na região tropical, por ser uma importante fonte alimentar para o Nordeste do Brasil. As viroses são fatores limitantes à produção de feijão-fava provocando danos que podem reduzir a produtividade, devido à dificuldade de controle e às formas eficientes de disseminação dos patógenos. No entanto, não são bem conhecidos os vírus que infectam naturalmente o feijão-fava. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar os vírus com genoma de RNA de ocorrência natural em campos produtores de feijão-fava nos estados do Piauí e Ceará, além de caracterizar por análises filogenéticas e sintomatológicas as espécies identificadas. Foram coletadas 55 amostras foliares de feijão-fava com sintomas de mosaico e deformação foliar durante a estação de cultivo dos anos de 2017 e 2018. Foram realizadas RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para Cucumber mosaic virus (CMV) e Cowpea mild mottle virus (CPMMV) e oligonucleotídeos degenerados para potyvírus e comovírus. Os fragmentos amplificados de tamanhos esperados de CMV, potyvírus e comovírus foram purificados e sequenciados em ambas as direções. As sequências editadas foram comparadas com aquelas depositadas no GenBank. Árvores filogenéticas foram geradas utilizando o método de máxima verossimilhança. As sequências nucleotídicas (nt) e de aminoácidos (aa) deduzidos foram comparadas entre si e com sequências de isolados referência. Foram identificadas quatro espécies de vírus infectando naturalmente o feijão-fava: CMV, Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) e CPMMV, os quais apresentaram taxa de infecção simples de 21,81%, 47,27%, 1,81% e 52,72%, respectivamente. Taxas de infecções duplas foram observadas entre CMV e CABMV (3,63%), CMV e CPMMV (16,3%), CABMV e CPMMV (12,7%), e infecção múltipla entre CMV, CABMV e CPMMV de 1,8%. A comparação das sequências nt de 11 isolados de CMV revelou identidade de 96 a 100% entre si, e de 94 a 99% com isolados referência do Subgrupo I e 80 a 81% com os isolados do Subgrupo II. Todos os isolados de CMV agruparam com isolados referência do Subgrupo IA. Os 16 isolados de CABMV possuem identidade de sequências de nt e aa com sequências de isolados depositados no GenBank variando de 90 a 95% e 96 a 97%, respectivamente. Quando comparados entre si, os isolados apresentaram identidade de sequência nt de 81 a 100%, e identidade de aa de 92 a 100%. Os isolados de CABMV agruparam com isolados brasileiros, africano e indiano. Apenas uma amostra de feijão-fava apresentou infecção com CPSMV. Esse isolado apresentou maior identidade (92% nt e 88% aa) com o isolado CPSMV PY2, obtido de sésamo no Paraguai. Estes resultados comprovam a ocorrência natural de CMV, CABMV, CPSMV e CPMMV em plantas de feijão-fava nos estados do Piauí e Ceará. É o primeiro relato de CPSMV e CPMMV em feijão-fava no mundo.

ABSTRACT:Lima bean (Phaseolus lunatus L.) is one of the main legumes grown in the tropical region, besides being an important food source for the Northeast of Brazil. Viruses are limiting factors for bean production causing damage that can reduce productivity, due to the difficulty of control and efficient forms of dissemination of the pathogens. However, viruses that naturally infect lima bean are not well known. Thus, the objective of this study was to identify the natural occurrence of viruses with RNA genomes in bean fields in the states of Piauí and Ceará, as well as to characterize the identified species by phylogenetic and symptomatological analyzes. Fifty-five leaf samples of lima beans with mosaic and foliar deformation symptoms were collected in the states of Piauí and Ceará during the growing season of 2017 and 2018. RT-PCR was performed with specific oligonucleotides for Cucumber mosaic virus (CMV) and Cowpea mild mottle virus (CPMMV) and degenerate oligonucleotides for potyviruses and as comoviruses. The amplified fragments of expected sizes of CMV, potyvirus and were purified and sequenced in both directions. The edited sequences were compared to those deposited in GenBank. Phylogenetic trees were generated using the maximum likelihood method. The deduced nucleotide (nt) and amino acid (aa) sequences were compared among the isolates obtained in this study with reference isolates sequences. Four species of virus were found naturally infecting fava beans: Cucumber mosaic virus (CMV), Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) and Cowpea mild mottle virus (CPMMV) of simple infection of 21.81% for CMV, 47.27% for CABMV, 1.81% for CPSMV and 52.72% for CPMMV, respectively. Rates of double infections were observed between CMV and CABMV (3.63%), CMV and CPMMV (16.3%), CABMV and CPMMV (12.7%), and multiple infection between CMV, CABMV and CPMMV of 1.8%. Comparison of the nt sequences of 11 CMV isolates revealed 96 to 100% identity to each other, and 94 to 99% with Subgroup I reference isolates and 80 to 81% to the Subgroup II isolates. All CMV isolates grouped with reference isolates of Subgroup IA with 93% bootstrap. The 16 CABMV isolates have nt sequence identity with GenBank isolates ranging from 90 to 95% and 96 to 97%, respectively. When compared to each other, the isolates showed high nt sequence identity of 81 to 100% and aa identity of 92 to 100%. The CABMV isolates grouped with Brazilian, African and Indian isolates, with 100% bootstrap. Only one sample of fava beans presented infection with CPSMV. This sample showed a greater identity (92% nt and 88% aa) with the isolate CPSMV PY2, obtained from sesame in Paraguay. These results confirm the natural occurrence of CMV, CABMV, CPSMV and CPMMV in lima bean plants in the states of Piauí and Ceará. It is the first report of CPSMV and CPMMV in lima bean in the world.