EFEITO DA ADIÇÃO DO ÁCIDO PALMÍTICO E DA VITAMINA E AO DILUIDOR TRIS-GEMA NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CANINO

Abstract

RESUMO:A criopreservação do sêmen é uma das principais biotécnicas aplicadas à reprodução animal, permitindo que ele seja armazenado, transportado e utilizado sempre que necessário. No entanto, esse procedimento reduz a fertilidade dos espermatozoides devido a lesões estruturais e funcionais advindas de estresse térmico, osmótico e oxidativo, decorrentes da redução de temperatura, armazenamento, descongelação e toxicidade dos crioprotetores. Dessa forma, a adição de ácido palmítico e vitamina E aos meios diluidores de congelação foi testada com a finalidade de preservar as estruturas espermáticas durante o processo de congelação. Vinte (20) amostras de sêmen foram colhidas de quatro (4) cães da raça American Pitbull de sanidade conhecida, reprodutores, com idade entre 1 a 6 anos, pesando entre 15 a 25Kg por meio de manipulação digital, separando-se a fração espermática, e, posteriormente realizando-se as avaliações macroscópicas e microscópicas das mesmas. Cada amostra de sêmen coletada foi diluída em diluidor Tris-Gema na concentração de 100x106 Sptz/ml e dividida igualmente em alíquotas de 3ml para então formarem os três grupos experimentais adicionando-se os antioxidantes, sendo eles: G1) Tris-Gema (Grupo controle); G2) Tris-Gema + 100 μM de ácido palmítico; G3) Tris-Gema + 116μM de vitamina E. As coletas de sêmen foram realizadas, semanalmente em um período de dois meses e sete dias. As amostras de sêmen foram congeladas em palhetas de 0,25ml e em um período mínimo de uma semana foram descongeladas para avaliação de alguns parâmetros, como, motilidade (MT) e vigor, integridade da membrana espermática, atividade mitocondrial e integridade do acrossomo, e análise da cinética espermática pelo Sistema de Análise Computadorizada do Sêmen (CASA) a fim de comparar os resultados entre os tratamentos. Para análise estatística dos dados, foram obtidas as médias e desvio-padrão, e procedida à análise de variância dos parâmetros avaliados. Para a comparação das médias foi realizado o teste de Duncan, de acordo com o coeficiente de variação obtido, considerando um nível de significância de 5%. Foi utilizado o PROC GLM (General Linear Models) do Software SAS (Statistical Analysis). Pelo teste de TTR, os antioxidantes em questão não apresentaram resultado significativo para os parâmetros de motilidade e vigor quando comparados ao controle. A vitamina E apresentou-se mais eficiente que o ácido Palmítico no parâmetro MT da análise CASA. Ácido Palmítico e Vitamina E não apresentaram efeitos significativos nos parâmetros de integridade acrossomal, atividade mitocondrial. Porém, espermatozoides criopreservados com Ácido Palmítico apresentaram resultados significativos para a integridade da membrana plasmática. Conclui-se que a suplementação do diluidor tris-gema com ácido palmítico na concentração 100μM, é capaz de preservar a integridade da membrana plasmática durante o processo de criopreservação do sêmen canino e a adição de 116μM de vitamina E não é suficiente para preservar as estruturas espermáticas.

ABSTRACT:Cryopreservation of semen is one of the main biotechnologies applied to animal reproduction, allowing it to be stored, transported and used whenever necessary. However, this procedure reduces sperm fertility due to structural and functional lesions due to thermal, osmotic and oxidative stress due to the reduction in temperature, storage, thawing and toxicity of the cryoprotectants. Thus, the addition of palmitic acid and vitamin E to the freezing dilution media was tested in order to preserve the sperm structures during the freezing process. Twenty (20) semen samples were collected from four (4) American Pitbull dogs of known sanity, breeders, aged 1 to 6 years, weighing between 15 and 25 kg by digital manipulation, separating the sperm fraction, and subsequently performing the macroscopic and microscopic evaluations of the same. Each collected semen sample was diluted in Tris-Gemma diluent at 100x106 Sptz/ml and divided equally into 3ml aliquots to form the three experimental groups, adding the following antioxidants: G1) Tris-Egg Yolk ); G2) Tris-Egg Yolk + 100 μM palmitic acid; G3) Tris-Egg Yolk + 116μM vitamin E. Semen collections were performed weekly in a period of two months and seven days. Semen samples were frozen in 0.25 ml vats and at least one week were thawed for evaluation of some parameters, such as motility (MT) and vigor, spermatic membrane integrity, mitochondrial activity and acrosome integrity, and analysis of sperm kinetics by the Computerized Semen Analysis System (CASA) in order to compare the results among the treatments. For the statistical analysis of the data, the means and standard deviation were obtained, and the analysis of variance of the evaluated parameters was performed. Duncan's test was used to compare the averages, according to the coefficient of variation obtained, considering a level of significance of 5%. PROC GLM (General Linear Models) of the SAS Software (Statistical Analysis) was used. By the TTR test, the antioxidants in question did not present significant results for the parameters of motility and vigor when compared to the control. Vitamin E was more efficient than the Palmitic acid in the MT parameter of the CASA analysis. Palmitic acid and Vitamin E did not present significant effects on the acrosomal integrity parameters, mitochondrial activity. However, spermatozoa cryopreserved with Palmitic Acid presented significant results for the integrity of the plasma membrane. It is concluded that the supplementation of the tris-egg yolk diluent with palmitic acid in the concentration 100μM, is able to preserve the integrity of the plasma membrane during the process of cryopreservation of canine semen, and the addition of 116μM of vitamin E is not enough to preserve the sperm structures.