ESTUDOS TOXICOLÓGICOS E NEUROFARMACOLÓGICOS NÃO CLÍNICOS DO - CARIOFILENO E DO SEU COMPLEXO DE INCLUSÃO- -CARIOFILENO/METIL -CICLODEXTRINA

Abstract

RESUMO;O -cariofileno ([(1R,4E,9S)-4,11,11-trimetil-8-metilidenebiciclo[7.2.0]undec-4-eno]) é um sesquiterpeno bicíclico com importante papel na química dos sesquiterpenóides que pode ser usado como aditivo alimentar e que apresenta várias atividades farmacológicas in vivo e in vitro. Esse sesquiterpeno natual têm atraído demasiado interesse do ponto de vista químico, diversidade estrutural, quimiotaxonômico e principalmente porque apresentam atividades farmacológicas direcionadas aos distúrbios do sistema nervoso central (epilepsia, depressão, ansiedade e doenças neurodegenerativas). No entanto, poucas informações toxicológicas têm sido relatadas e seu uso é baseado no fato de que esse sesquiterpeno bicíclico é diariamente consumido como alimento vegetal em quantidades muito maiores do que como um aditivo alimentar. Dessa forma, estudos toxicológicos que visam avaliar possíveis efeitos adversos é de suma importância. Adicionalmente, estudos além do toxicológico destacam a necessidade de avaliações experimentais contínuas para determinar os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos farmacológicos do -cariofileno em relação à doenças do sistema nervoso central como ansiedade, depressão e epilepsia. Assim, o presente estudo avaliou primeiramente a toxicidade aguda (dose única) e em doses repetidas (28 dias) do -cariofileno administrado por via oral nas doses de 300 e 2000 mg/kg em camundongos Swiss fêmeas analisando alterações no peso corporal, consumo de alimento, ingestão de água, parâmetros hematológicos e bioquímicos, peso de órgãos após necropsia, biomarcadores de estresse oxidativo e histopatologia de vários tecidos vitais. O estudo de toxicidade aguda (300 e 2000 mg/kg) e em doses repetidas (300 e 2000 mg/kg) foram realizados de acordo com a diretriz 423 e 407 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD), respectivamente. Já o potencial neurofarmacológico do -cariofileno (100, 200 e 400 mg/kg) foi avaliado por modelos experimentais usando o teste do campo aberto, rota rod, labirinto em cruz elevado, suspensão pela cauda e nado forçado, bem como os modelos de crises epiléticas induzido por pilocarpina, pentilenotetrazol e isoniazida. Adicionalmente, o modelo experimental de depressão induzido por dor neuropática foi utilizado para determinar o potencial antidepressivo do -cariofileno livre (100 e 200 mg/kg) e -cariofileno complexado com metil- -ciclodextrina (50 e 100 mg/kg). É importante destacar que o -cariofileno apresenta algumas características como volatilidade e baixa solubilidade em água, sendo que técnicas como complexações com ciclodextrinas pode melhorar a solubilidade, estabilidade e liberação controlada desse sesquiterpeno. O método de liofilização foi utilizado no presente estudo para obtenção do complexo de inclusão do - cariofileno com metil- -ciclodextrina após a preparação da mistura física num almofariz na proporção molar 1:1 ( -cariofileno e metil- -ciclodextrina). Os resultados obtidos destacaram ausência de sinais clínicos adversos e mortalidade em qualquer animal submetido ao estudo de toxicidade em dose única e em doses repetidas. Além disso, não foram observadas alterações significativas no peso corporal, biomarcadores oxidativos (catalase, superóxido dismutase e peroxidação lipídica), parâmetros hematológicos (eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina) e bioquímicos (glicose, ureia, creatinina e ácido úrico) quando comparado com o grupo controle do estudo de toxicidade em dose única e em doses repetidas. As observações dos efeitos neurofarmacológicos resultaram na possível compreensão dos mecanismos neuromoleculares subjacentes às propriedades ansiolíticas e anticonvulsivantes que podem envolver os receptores benzodiazepínicos/GABAérgicos, uma vezque o pré-tratamento do -cariofileno (200 mg/kg) com flumazenil (reconhecido antagonista do receptor benzodiazepínico) ou bicuculina (antagonista do receptor GABAA) reestabeleceu os parâmetros de ansiedade no labirinto em cruz elevado, bem como os resultados de redução da latência para consumir o alimento no teste da alimentação suprimida pela novidade. No mesmo teste usando outro grupo de animais, as propriedades farmacológicas do -cariofileno podem estar relacionadas a inibição da síntese de óxido nítrico, uma vez que o pré-tratamento com L-arginina reverteu significativamente os resultados ansiolíticos, antidepressivos e anticonvulsivantes do -cariofileno (200 mg/kg) (p<0,05). Adicionalmente, os resultados obtidos nas propriedades neurofarmacológicos sugerem que os receptores serotoninérgicos dos tipos 5-HT2A e 5-HT3 não estão envolvidos nas propriedades ansiolíticas, antidepressivas e anticonvulsivantes do -cariofileno. Além dos resultados já abordados, foi demonstrado que o -cariofileno complexado (100 mg/kg) quando administrado em camundongos Swiss com constrição do nervo ciático e comportamento semelhante à depressão quando verificado pelo aumento do tempo total de imobilidade no teste da suspensão pela cauda e nado forçado, foi mais efetivo no efeito antidepressivo com uma dose inferior ao -cariofileno não complexado ou livre (200 mg/kg). Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo destacam uma premissa interessante no possível uso do complexo de inclusão - cariofileno/metil- -ciclodextrina para o desenvolvimento de formulações farmacêuticas de dosagem oral com biodisponibilidade aumentada em propriedades antidepressivas. ABSTRACT:-caryophyllene [(1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylidenebicyclo [7.2.0]undec-4-ene] is a bicyclic sesquiterpene with an important role in sesquiterpenoid chemistry that can be used as a food additive and has various pharmacological activities in vivo and in vitro. This natural sesquiterpene has attracted too much interest from the chemical point of view, structural diversity, chemotaxonomic and mainly because they present pharmacological activities directed to central nervous system disorders (epilepsy, depression, anxiety and neurodegenerative diseases). However, little toxicological information has been reported and its use is based on the fact that this bicyclic sesquiterpene is daily consumed as a plant food in much larger quantities than as a food additive. Thus, toxicological studies aimed at evaluating possible adverse effects is of paramount importance. Additionally, studies beyond toxicology highlight the need for ongoing experimental evaluations to determine the molecular mechanisms underlying the pharmacological effects of -caryophyllene in relation to central nervous system disorders such as anxiety, depression and epilepsy. Therefore, the present study evaluated the acute toxicity (single dose) and repeated doses (28 days) of -caryophyllene administered orally in female Swiss mice analyzing changes in body weight, feed intake, water intake, hematological and biochemical parameters and organ weight after necropsy, oxidative stress biomarkers and histopathology of various vital tissues. The acute toxicity study using (300 and 2000 mg/kg) and repeated doses (300 and 2000 mg/kg) were performed according to the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) guidelines 423 and 407 respectively. The neuropharmacological potential of -caryophyllene (100, 200 and 400 mg/kg) was evaluated using animal models in the open field test, rotated rod, elevated plus maze, tail suspension and forced swimming, as well as models of epileptic seizures induced by pilocarpine, pentylenetetrazol and isoniazid. Additionally, the animal model of depression induced by neuropathic pain was used to determine the antidepressant potential of free - caryophyllene (100 and 200 mg/kg) and complex -caryophyllene with methyl- -cyclodextrin (50 and 100 mg/kg). It is important to highlight that -caryophyllene displays some characteristics such as volatility and low solubility in water, and techniques such as complexation with cyclodextrins can improve the solubility, stability and controlled release of this sesquiterpene. The lyophilization method was used in the present study to obtain the inclusion complex of -caryophyllene with methyl- -cyclodextrin after preparation of the physical mixture in a 1:1 molar ratio ( -caryophyllene and methyl- -cyclodextrin) in mortar. The results showed the absence of adverse clinical signs and mortality in any animal that went through a single dose and repeated dose toxicity study. In addition, no significant changes in body weight, oxidative biomarkers (catalase, superoxide dismutase and lipid peroxidation), hematological parameters (erythrocytes, leukocytes, platelets, hemoglobin) and biochemical parameters (glucose, urea, creatinine and uric acid) were observed when compared with the control group of single-dose and repeat-dose toxicity study. Observations of neuropharmacological effects have resulted in a possible understanding of the neuromolecular mechanisms underlying anxiolytic and anticonvulsant properties that may involve benzodiazepine/GABAergic receptors, since pretreatment of -caryophyllene (200 mg/kg) with flumazenil (a recognized antagonist of benzodiazepine receptor) or bicuculline (GABAA receptor antagonist) reestablished the anxiety parameters in the elevated plus maze, as well as the results of reduced food consumption latency in the novelty suppressed feeding test. In the same test using another group of animals, the pharmacological properties of -caryophyllene may be related to inhibition of nitric oxide synthesis, since pretreatment with L-arginine significantly reversed anxiolytic, antidepressant and anticonvulsant results of caryophyllene (200 mg/kg) (p<0,05). Additionally, the results obtained in the neuropharmacological properties suggest that 5-HT2A and 5-HT3 serotoninergic receptors are not involved in the anxiolytic, antidepressant and anticonvulsant properties of -caryophyllene. In addition to the results already discussed, it has been shown that complexed -caryophyllene (100 mg/kg) when administered in Swiss mice with sciatic nerve constriction and behavior similar to depression- like behavior when verified by increasing the total immobility time in the tail suspension and forced swimming test was more effective in antidepressant effect at a dose lower than uncomplexed or free -caryophyllene (200 mg/kg). Thus, the results obtained in the present study highlight an interesting premise on the possible use of the -caryophyllene/methyl- - cyclodextrin inclusion complex for the development of oral dosage forms with increased bioavailability in antidepressant properties.