SISTEMA DE CO-CULTIVO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

Abstract

RESUMO:O aprimoramento de sistemas de cultivo de folículos ovarianos pré-antrais tem sido objeto de investigação em diferentes espécies. As células-tronco mesenquimais (CTM) surgem como uma importante ferramenta para a realização de técnicas de cultivo associadas aos folículos ovarianos pré-antrais, devido ao seu potencial de induzir a proliferação e a sobrevivência de vários tipos de células bem como a facilidade de obtenção e sua expansibilidade in vitro. Esta pesquisa tem por objetivo avaliar o uso de células-tronco mesenquimais da Geleia de Wharton (CTM-GW) no desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais caprinos, por meio de dois sistemas de cultivo, com folículos inclusos no córtex ovariano ou isolados deste. Na primeira etapa, os fragmentos foram fixados imediatamente, (controle não-cultivado) ou distribuídos em quatro tratamentos: tecido ovariano cultivado em meio essencial mínimo (α-MEM+) para o controle; tecido ovariano cultivado em α-MEM+ suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) (α-MEM+ + SFB); tecido ovariano co-cultivado com células-tronco (CT) em α-MEM+ (α-MEM+ + CT); e finalmente tecido ovariano co-cultivado com célula-tronco em α-MEM+ e SFB (α-MEM+ + CT + SFB). Após o cultivo, foram analisadas as taxas de sobrevivência, a ativação e o diâmetro folicular e a taxa de proliferação celular. Já, na segunda etapa, os folículos secundários foram isolados e distribuídos em dois tratamentos: folículos ovarianos cultivados em meio essencial mínimo (α-MEM+), na ausência (controle) ou presença de células-tronco. Os folículos foram cultivados em placas de 24 poços durante 18 dias, sendo 2 folículos por poço, com troca parcial do meio a cada dois dias e nos dias 6 e 18, coletados para dosagem hormonal. Após cultivo, foram avaliadas a morfologia e taxas de crescimento folicular, formação de antro, produção de estradiol (E2), progesterona (P4) e Glutationa reduzida (GSH) no meio proveniente das trocas, bem como as taxas de viabilidade e de maturação oocitária. Foi observado, na primeira etapa, que após 7 dias, o tratamento co-cultivo com células-tronco apresentou um percentual de folículos pré-antrais morfologicamente normais superior (P < 0,05) quando comparado aos demais tratamentos bem como uma maior (P < 0,05) taxa de ativação em relação ao controle cultivado. Ademais, o diâmetro folicular foi maior no tratamento co-cultivo com células-tronco em relação ao co-cultivo com células-tronco acrescido de SFB. Na segunda etapa, o tratamento com células-tronco foi o único que apresentou um aumento significativo e progressivo no diâmetro folicular ao longo do cultivo bem como mostrou maior (P < 0,05) taxa de crescimento folicular diário. As taxas de retomada da meiose e maturação oocitária foram semelhantes entre os tratamentos. Neste estudo, observou-se pela primeira vez que as CTM-GW têm potencial de utilização como suporte para o crescimento dos folículos pré-antrais. O sistema de co-cultivo de folículos inclusos no córtex ovariano com CTM contribuiu para melhorar a taxa de ativação, manteve a sobrevivência folicular e desenvolvimento folicular in vitro e na forma isolada influenciou no crescimento folicular.

ABSTRACT:Improvement of pre-antral ovarian follicle cultivation systems has been investigated in different species. Mesenchymal stem cells (MSC) have emerged as an important tool for performing pre-antral ovarian follicle associated cultivation techniques because of their potential to induce proliferation and survival of various cell types, as well as their ease of obtaining and their expandability in vitro. The objective of this research is to evaluate the use of Wharton jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) in the development of goat pre-antral ovarian follicles, by means of two culture systems, with follicles included in or isolated from the ovarian cortex. in the first stage, the fragments were either fixed immediately (uncultivated control) or distributed into four treatments: ovarian tissue cultivated in minimal essential medium (α-MEM+) for control; ovarian tissue cultured in α-MEM+ supplemented with Fetal Bovine Serum (FBS) (α-MEM+ + FBS); stem cell (SC) co-cultured ovarian tissue in α-MEM + (α-MEM + + SC); and finally stem cell co-cultured ovarian tissue in α-MEM+ and FBS (α-MEM + + SC + FBS). After cultivation, survival rates, activation and follicular diameter and cell proliferation rate were analyzed. In the second stage, secondary follicles were isolated and distributed in two treatments: ovarian follicles cultivated in minimal essential medium (α-MEM +), in the absence (control) or presence of stem cells. The follicles were cultured in 24-well plates for 18 days, with 2 follicles per well, with partial medium change every two days and on days 6 and 18, collected for hormonal dosing. After cultivation, the morphology and rates of follicular growth, antrum formation, estradiol production (E2), progesterone (P4) and reduced glutathione (GSH) in the medium were evaluated, as well as viability and oocyte maturation rates. In the first stage, it was observed that after 7 days, the co-cultivation treatment with stem cells presented a higher percentage of morphologically normal preantral follicles (P < 0.05) when compared to the other treatments as well as a larger one (P < 0.05) activation rate in relation to the cultivated control. In addition, follicular diameter was higher in co-cultivation with stem cells compared to co-cultivation with FBS. In the second stage, the treatment with stem cells was the only one that showed a significant and progressive increase in follicular diameter throughout the culture and showed a higher (P < 0.05) daily follicular growth rate. The rates of meiosis resumption and oocyte maturation were similar between treatments. In this study, it was observed for the first time that WJ-MSC have potential use as support for the growth of preantral follicles. The co-cultivation system of follicles included in the ovarian cortex with MSC contributed to improve the activation rate, maintained follicular survival and follicular development in vitro and in isolated form influenced follicular growth.