CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÕES CARDIOVASCULARES DE UM NOVO PEPTÍDEO RICO EM PROLINA OBTIDO DA SECREÇÃO CUTÂNEA DE BRACHYCEPHALUS EPHIPPIUM

Abstract

RESUMO: O presente estudo descreve o isolamento e a caracterização químico-farmacológica e toxicológica de um novo oligopeptídeo rico em prolina (PRO) isolado a partir da secreção cutânea do anfíbio Brachycephalus ephippium (Spix, 1824), denominado BPP-Brachy, e sua forma amidada, BPP-BrachyNH2, ambas encontradas na forma natural. O Capítulo I apresenta breve revisão sobre a descoberta dos PROs a partir do veneno da serpente Bothrops jararaca (Wied-Neuwied, 1824) e suas potenciais fontes e aplicações biológicas. No Capítulo II, BPP-BrachyNH2 foi caracterizado quimicamente e apresentou efeito inibitório sobre a atividade da ECA in vitro em soro de ratos, com evidências in silico indicando maior energia de interação em direção ao sítio ativo do domínio C do que ao domínio N, assim como induziu vasodilatação dependente de endotélio em anéis de artéria aorta torácica de rato. A presença de L-NAME, um inibidor da óxido nítrico (NO) sintase, assim como a remoção mecânica do endotélio vascular aboliram a vasodilatação induzida por BPP-BrachyNH2. Em anéis de aorta previamente carregados com a sonda DAF-FM DA (Diacetato de 4-amino-5-metilamino-2',7'-difluorofluoresceína), BPP-BrachyNH2 promoveu aumento de fluorescência observado por microscopia confocal, indicando aumento na liberação de NO. A viabilidade celular de linhagens de células endoteliais de veia umbilical humana, de músculo liso vascular de aorta de rato e de macrófagos murinos foi avaliada pelo método do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] na presença de BPP-BrachyNH2, que demonstrou ausência de citotoxicidade nas concentrações testadas. No Capítulo III, a toxicidade aguda foi avaliada em camundongos Swiss fêmeas tratadas com BPP-BrachyNH2 (5 e 50 mg/kg) por via intraperitoneal, de acordo com o Guia OECD nº 423 (Método de Classe Tóxica Aguda). Nos ensaios toxicológicos in vivo, não foram observadas mortes ou outro sinal de toxicidade. No Capítulo IV, BPP-BrachyNH2 apresentou efeito vasorelaxante em anéis de artérias de resistência isoladas do leito mesentérico de rato e da circulação coronária de porco, possivelmente envolvendo o aumento da produção de NO em decorrência do aumento da biodisponibilidade de L-arginina e a ativação de receptores de bradicinina B2, respectivamente. Em conclusão, o peptídeo BPP-BrachyNH2 apresenta uma sequência primária inédita nos bancos de dados internacionais e é o primeiro BPP isolado a partir da secreção cutânea em toda a família Brachycephalidae. Estes achados abrem a possibilidade para se bioprospectar anfíbios como fontes de novas biomoléculas e com ação cardiovascular, assim como para suas potenciais aplicações no tratamento de disfunções endoteliais. ABSTRACT: The present study describes the isolation as well as the chemical, pharmacological, and toxicological characterization of a new proline-rich oligopeptide (PRO) isolated from the skin secretion of the frog Brachycephalus ephippium (Spix, 1824) called BPP-Brachy, and its amidated form BPP-BrachyNH2, both found in natural form. The Chapter I present brief review on the first identification of PROs from Bothrops jararaca (Wied-Neuwied, 1824) venom and their potential biological sources and applications. In the Chapter II, BPP-BrachyNH2 was chemically characterized and efficiently inhibited in vitro ACE activity in rat serum, with in silico evidences about higher interaction energy towards the active site of the C-domain then the N-domain, as well as induces endothelium-dependent vasodilation in rat thoracic aorta preparations. The presence of L-NAME, an inhibitor of nitric oxide (NO) synthase, as well as the mechanical removal of the vascular endothelium, abolish BPP-BrachyNH2-induced vasodilation. In DAF-FM DA (4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate)-loaded aortic rings, BPP-BrachyNH2 promoted increase of fluorescence measured by confocal microscopy, indicating an increase of NO release. The cell viability of human umbilical vein endothelial cells, rat aortic smooth muscle cells, and murine macrophages in the presence of BPP-BrachyNH2 was assessed by the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] method, which showed absence of cytotoxicity at the concentrations tested. In the Chapter III, the acute toxicity was evaluated in female Swiss mice treated intraperitoneally with BPP-BrachyNH2 (5 e 50 mg/kg) according with the OECD nº 423 Guidance (Acute Class Toxic Method). In the in vivo toxicological assessment, neither death nor signs of toxicity was observed. In the Chapter IV, BPP-BrachyNH2 presented vasorelaxant effect in both rat small mesenteric and porcine small coronary arteries, possibly involving the increase of NO production related to the increase of L-arginine bioavailability as well as the activation of bradykinin B2 receptors, respectively. In conclusion, the peptide BPP-BrachyNH2 presents a novel primary sequence in international databases and is the first BPP isolated from the skin secretion across the Brachycephalidae family. These findings open for the possibility to bioprospect the amphibians as sources of new biomolecules with cardiovascular actions as well as their potential applications in the treatment of endothelial dysfunctions.