UTILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE FE3O4@AU COMO NANOPLATAFORMA PARA O DESENVOLVIMENTO DE GENOENSAIOS ELETROQUÍMICOS PARA DETECÇÃO DE MILHO

Abstract

RESUMO:O presente trabalho aborda um avanço tecnológico aplicado ao desenvolvimento de genoensaios eletroquímicos através da imobilização de sondas de DNA em nanoplataformas constituídas por nanopartículas magnéticas de Fe3O4@Au núcleo@revestimento. Estas nanoplataformas foram utilizadas na construção de dispositivos analíticos, para a detecção e quantificação do gene endógeno de alta mobilidade HMGA específico do milho a ser utilizado na quantificação relativa do evento de milho Geneticamente Modificado MON810. Um eletrodo de ouro obtido por sputtering sobre um filme de poliéster foi utilizado como eletrodo de trabalho para deposição das NPM Fe3O4@Au e para a transdução eletroquímica, usando-se a enzima peroxidase como marcador e amplificador do sinal eletroquímico obtido na reação de hibridização de cadeias complementares do DNA correspondente ao HMGA. Os compostos tiolados acido 6-mercaptohexanoico e 6-mercaptohexan-1-ol foram usados para funcionalizar as nanopartículas através da formação de bicamadas automontadas. As nanopartículas apresentaram-se esféricas e uniformes com  10 nm de diâmetro com elevada eficiência de separação, o que associado à sua biocompatibilidade permitiu uma imobilização do DNA bem orientada. O genoensaio foi construído usando-se um formato de hibridização em sanduiche de modo a aumentar a seletividade do ensaio eletroquímico em condições otimizadas: (1) 6 mercaptohexan-1-ol (0,1 mol.L-1) e ácido 6-mercaptohexanoico (0,1 mol.L-1) na proporção de 6:1; (2) Fe3O4@Au de 0,06 mg/ensaio; (3) hibridização homogênea a 98 °C, por 30 min; (4) hibridização heterogênea em 1 hora. Nestas condições, obtiveram-se curvas de calibração com intervalo linear entre 0,0 e 5,0 nmol.L-1 de DNA com coeficiente de correlação de 0,9995, LOD de 0,094 nmol.L-1 e LOQ de 0,313 nmol.L-1. A precisão do genoensaio variou entre 0,9 a 1,2 %. O método levou ao aumento de sensibilidade e não necessitou de prévia purificação e foi testado em amostras comerciais de milho. Os resultados experimentais mostraram que esta proposta apresenta-se como inovadora e acessível, com potencial para ser aplicada em análises quantitativas para a verificação da conformidade dos regulamentos de culturas GM.ABSTRACT:The present work addresses a technological advance applied to the development of electrochemical genoassays through the immobilization of DNA probes in nanoplatforms composed of magnetic nanoparticles of Fe3O4@Au core@shell. This nanoplatform was used in the construction of analytical devices for the detection and quantification of the endogenous high mobility HMGA specific gene to be used in the relative quantification of the genetically modified maize event MON810. A gold electrode obtained by Sputtering on a polyester film was used as a working electrode for the deposition of Fe3O4@Au MNP and for the electrochemical transduction, using the peroxidase enzyme as marker and amplifier of the electrochemical signal obtained in the hybridization reaction of complementary strands of the DNA corresponding to HMGA. The thiolated compounds 6-mercaptohexanoic acid and 6-mercaptohexan-1-ol were used to functionalize the nanoparticles by forming self-assembled bilayers. The nanoparticles were spherical and uniform with  10 nm in diameter with high separation efficiency, which combined with their biocompatibility allowed a well-oriented DNA immobilization. The genoassay was constructed using a sandwich hybridization format to increase the selectivity of the electrochemical assay under optimized conditions: (1) 6-mercaptohexan-1-ol (0.1 mol.L-1) and 6-mercaptohexanoic acid (0.1 mol.L-1) in the ratio of 6: 1; (2) Fe3O4@Au of 0.06 mg/assay; (3) homogeneous hybridization at 98 ºC for 30 min; (4) heterogeneous hybridization in 1 hour. Under these conditions calibration curves were obtained with linear interval between 0.0 and 5.0 nmol.L-1 DNA with correlation coefficient of 0.9999, LOD of 0.094 nmol.L-1 and LOQ of 0.313 nmol.L-1. The accuracy of the genoassay ranged from 0.9 to 1.2%. The method led to increased sensitivity and did not require prior purification and was tested in commercial maize samples. The experimental results showed that this proposal is presented as innovative and accessible, with the potential to be applied in quantitative analyzes to check the conformity of genetically modified crop regulations.