EFICÁCIA DO POLISSACARÍDEO SULFATADO EXTRAÍDO DA ALGA MARINHA VERMELHA Hypnea musciformis CONTRA DIARREIA EM ROEDORES

Abstract

RESUMO: As algas marinhas são fonte de diversos compostos biologicamente ativos com potencial ação terapêutica, como os polissacarídeos sulfatados (PLS), os quais são reconhecidos por apresentarem um grande número de atividades biológicas, incluindo ação moduladora gastrointestinal. Considerando que a diarreia é a manifestação clínica mais frequente relacionada com doenças gastrointestinais e que atualmente não existe um tratamento específico destinado a esse problema clínico, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia antidiarreica do PLS extraído na alga marinha vermelha H. musciformis, bem como avaliar os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito. Os procedimentos e protocolos experimentaisutilizados nesse estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará (Protocolo n° 11/2013). Inicialmente, o efeito antidiarreico do PLS foi avaliado no modelo de diarreia aguda e enteropooling induzido por óleo de rícino. Dessa forma, ratos wistar (150-180 g) foram pré-tratados com salina (2,5 ml/kg, v. o.), ou loperamida (5 mg/kg, v. o.), ou PLS (10, 30 e 90 mg/kg, v. o.). Uma hora depois os ratos receberam óleo de rícino (10 ml/kg, v. o.). Após 3 horas foi avaliada a severidade da diarreia, o número total de fezes, o número total de fezes diarreicas e a medição do volume do conteúdo intestinal (enteropooling). Além disso, a partir da indução da diarreia com óleo de rícino, foi avaliada a atividade da proteína Na+ K+ ATPase presente no intestino delgado de camundongos (swiss; 25-30g) mensurada partir da hidrólise do ATP. Em outros grupos experimentais, com camundongos, foi realizado o teste de motilidade intestinal, utilizando 0,2 ml de carvão (v. o.) como marcador da distância percorrida ao longo do intestino. Para verificar um possível envolvimento de mecanismo opióide e/ou colinérgico na atividade do PLS sobre o trânsito intestinal foi utilizado naloxona (2 mg/kg, s. c.; antagonista opioide) e betanecol (3 mg/kg, i. p.; agonista colinérgico), respectivamente. Para o estudo do esvaziamento gástrico, outro grupo experimental (camundongos) foi tratado com PLS (90 mg/kg, v. o.) e uma hora depois receberam uma solução glicosada (5%) contendo vermelho de fenol (0,75 mg/ml). Após 20 minutos, os animais foram eutanasiados e o esvaziamento gástrico foi avaliado por técnica de espectrofotometria. O efeito antidiarreico do PLS ainda foi analisado pelo modelo de diarreia inflamatória induzida por prostaglandina E2 (PGE2), em ratos. Assim, os animais foram prétratados com PLS (90 mg/kg, v. o.) e imediatamente após a administração, PGE2 (100 μg/kg, v.o.) foi administrada. Após 30 minutos, os animais foram eutanasiados e o volume do contéudo intestinal foi mensurado. Foi utilizado o modelo de secreção intestinal induzida pela toxina da cólera (TC) (1 μg/alça) em camundongos para caracterizar a atividade antissecretória do PLS. A seguir, foi determinada a concentração de íons cloreto no fluido intestinal acumulado em cada alça isolada, bem como foi avaliado o feito do PLS na absorção intestinal. Além disso, a capacidade de ligação do PLS ao receptor monossialogangliosídeo-GM1 foi analisada por meio da técnica de ELISA. O pré-tratamento com todas as doses do PLS (10, 30 e 90 mg/kg) inibiu significativamente (P < 0,05) a diarreia induzida por óleo de rícino, com redução do número total de fezes, número total de fezes diarreicas e severidade da diarreia. A dose de 90 mg/kg reduziu significativamente (P < 0,05) o efeito antidiarreico no enteropooling induzido por óleo de rícino, aumentou (P < 0,05) a atividade da proteína Na+ K+ ATPase no intestino delgado, reduziu (P < 0,01) o trânsito intestinal, possivelmente por meio da ativação de receptores colinérgicos, além de inibir (P < 0,05) o enteropooling induzido por PGE2. Contudo, o PLS não mostrou influência no esvaziamento gástrico. Além disso, a secreção de fluido e os níveis de cloreto presentes no conteúdo intestinal induzidos pela TC, foram reduzidos significativamente (P < 0,001) nos animais pré-tratados com PLS, provavelmente devido a interação com o receptor GM1. Em conclusão, os resultados sugerem que o PLS exerce seu efeito antidiarreico devido a capacidade em aumentar a atividade de Na+ K+ ATPase no intestino delgado, inibir a motilidade intestinal associada a uma possível atividade anticolinérgica, bem como bloquear a ligação TC-GM1. ABSTRACT: Seaweeds are source of several biologically active compounds with potential therapeutic action,such as sulfated polysaccharides (PLS), which are known to have a variety of biological activities, including gastrointestinal modulatory action. Considering that diarrhea is the most common clinical manifestation related gastrointestinal diseases and currently there is no specific treatment for this medical condition, the objective of this study was to evaluate the effectiveness of anti-diarrheal PLS extracted in red seaweed H. musciformis and to assess the possible mechanisms involved in this effect. Experimental procedures and protocols used in this study were approved by the Ethics Committee in Research of the Federal University of Ceará (protocol no. 11/2013). Initially, the antidiarrheal effect of PLS was evaluated in the model of acute diarrhea and enteropooling induced by castor oil. Thus, wistar rats (150-180 g) were pretreated with saline (2,5 ml/kg, p. o.), or loperamide (5 mg/kg, p. o.), or PLS (10, 30 e 90 mg/kg, p. o.). One hour later the rats receive castor oil (10 ml/kg, p. o.). After 3 hours was evaluated the severity of the diarrhea, number of feces, total number of diarrheal stools and measuring the volume of intestinal contents (enteropooling). Furthermore, from the induction of diarrhea castor oil, was evaluated the protein activity Na+ K+ ATPase present in the small intestine of mice (swiss; 25-30g) assayed as a release of inorganic phosphate from the hydrolysis of ATP. In other experimental groups, with mice, was performed intestinal motility test, using 0.2 ml of charcoal (p. o.) as marker of distance traveled along the intestine. To verify a possible involvement of mechanism opioid and/or cholinergic in activity of PLS on intestinal transit was used naloxone (2 mg/kg, s. c.; opioid antagonist) and bethanechol (3 mg/kg, i. p.; cholinergic agonist), respectively. To evaluate gastric emptying, other experimental group (mice) were treated orally with PLS (90 mg/kg) and one hour later received a glucose solution (5%) containing phenol red (0.75 mg/ml). After 20 minutes, the animals were euthanized and gastric emptying was assessed by spectrophotometry technique. The antidiarrheal effect was further analyzed by PLS diarrhea inflammatory model induced by prostaglandin E2 (PGE2) in rats. Thus, the animals were pretreated with PLS (90 mg/kg, p. o.) and immediately after administration, PGE2 (100 mg/kg, p. o.) was administered. After 30 minutes, the animals were euthanized and intestinal content was measured. We used the intestinal secretion model induced by cholera toxin (CT) (1 μg/loop) in mice to characterize the antisecretory activity of PLS. Next, was determined the concentration of chloride ions in the intestinal fluid accumulated in each closed loop, and was evaluated the effect of PLS in the intestinal absorption. In addition, the binding ability of the PLS to monosialoganglioside-GM1 receptor was analyzed by ELISA. The pre-treatment with all doses of PLS (10, 30 and 90 mg/kg) inhibited significantly (P < 0.05) diarrhea induced by castor oil, with reduction of the total number of feces, total number of diarrheal stools and severity of diarrhea. The dose of 90 mg/kg reduced significantly (P < 0.05) antidiarrheal effect on enteropooling induced by castor oil, increased (P < 0.05) protein activity Na+ K+ ATPase activity in the small intestine, reduced (P < 0.01) intestinal transit, possibly through the activation of cholinergic receptors, and inhibit (P < 0.05) the enteropooling induced PGE2. However, the PLS no showed effect on gastric emptying. In addition, fluid secretion and chloride levels present in the intestinal contents induced by CT were significantly reduced (P < 0.001) in animals pretreated with PLS, probably due to interaction with the GM1 receptor. In conclusion, the results suggest that PLS exerts its antidiarrheal effect due to the ability to increase the activity of Na+ K+ ATPase activity in the small intestine, inhibit the intestinal motility associated with a potential anticholinergic activity, as well as block CT-GM1 binding.