AVALIAÇÃO TOXICOGENÉTICA DE PRODUTOS NATURAIS ISOLADOS DE FUNGOS ASSOCIADOS DE ALGAS MARINHAS PARA FORMULAÇÕES ANTITUMORAIS

Abstract

RESUMO Os fungos endófitos marinhos são ricos em metabólitos secundários e constituem uma importante fonte na procura por novos agentes terapêuticos. O estudo objetivou investigar o perfil toxicogenético do extrato acetonitrila e dos metabólitos dicitrinina-A e citrinina, obtidos do P. citrinum em Artemia salina, Allium cepa e Saccharomyces cerevisiae, como análises preliminares para a avaliação tóxica, citotóxica, genotóxica e antitumoral da citrinina em modelos murinos para Sarcoma 180 e para câncer de mama induzido por 7,12- dimetilbenzantraceno, com monitoramentos comportamentais, bioquímicos, histopatológicos e imuno-histoquímicos (Ki-67). As substâncias isoladas foram identificadas através de técnicas espectrométricas e espectroscópicas. Náuplios de A. salina foram expostos por 24 e 48 horas e A. cepa por 72 horas às substâncias. A avaliação oxidante/antioxidante foi feita em pré, co- e pós-tratamento com H2O2 em S. cerevisiae. A citrinina nas concentrações de 0,5; 1,0 e 2 µg/mL foi incubada durante 68 horas em células do líquido ascítico de Sarcoma180 e reincubadas durante 4h em estufa a 37C e a 5% CO2 após adição de suspensão de células, 20 L de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium] (5 mg/mL). Em seguida 0,5 x 106 células/mL da suspensão foram submetidas aos testes cometa alcalino e de micronúcleos. O câncer de mama em Mus musculus, fêmeas virgens, foi induzido pelo 7,12-dimetilbenzantraceno (6 mg/Kg, v.o.). O veículo foi o azeite de oliva (10 mL/Kg), citrinina testada em 2 µg/Kg-1, v.o. e a ciclofosfamida (25 mg/Kg-1, i.p.), como controle positivo. A indução do câncer de mama ocorreu em onze semanas e a terapia com citrinina em 3 semanas. Em A. salina, o extrato acetonitrila, citrinina e a dicitrinina-A apresentaram toxicidade com CL50 (24 horas) de 2,03 µg/mL, 1,71 µg/mL e 2,29 µg/mL, bem como CL50 (48 horas) de 0,51 µg/mL, 0,54 µg/mL e 0,54 µg/mL, respectivamente. Em A. cepa, as substâncias foram citotóxicas pelo baixo índice mitótico e mutagênicos pelo aumento de micronúcleos e de alterações cromossômicas. O extrato e seus metabólitos, em S. cerevisiae, somente em baixas concentrações, foram antioxidantes frente ao H2O2 em linhagens proficientes e mutantes para a superóxido dismutase citoplasmática e mitocondrial. A CI50 da citrinina, em células de S-180 foi de 3,77 µg/mL e nas concentrações 12,5 e 100 µg/mL, foi tão citotóxica quanto à doxorrubicina (2 µg/mL). Em 0,5; 1,0 e 2 µg/mL, citrinina induziu genotoxicidade e mutagenicidade em células de S-180, especialmente em 2 µg/mL, por danos oxidativos similares ao peróxido de hidrogênio (10 mM), por mecanismos associados a danos citogenéticos, especialmente apoptoses. O câncer de mama foi caracterizado como carcinoma mamário invasivo pela imuno-histoquímica e análise histopatológica. A citrinina induziu efeitos genotóxicos em células da mama, medula, linfócitos e fígado, e efeitos mutagênicos pela formação de micronúcleos, pontes, brotos e células binucleadas em medula óssea e fígado. Não foram observadas alterações nos pesos dos órgãos, exceto nas mamas. Efeitos similares da genotoxicidade foram observados para citrinina e ciclofosfamida, mas reparo de danos em linfócitos foi observado apenas na terapia com citrinina, que apresentou ação antitumoral, por mecanismos citogenéticos, possivelmente, associado a estresse oxidativo. Os metabólitos secundários obtidos do extrato acetonitrila do P. citrinum são fontes promissoras para formulações farmacêuticas antitumorais. ABSTRACT Marine endophyte fungi are rich in therapeutic agents. Our study aimed to investigate the toxicogenetic profile of the acetonitrile extract and the metabolites dicitrinin-A and citrinin, obtained from P. citrinum in Artemia salina, Allium cepa and Saccharomices cerevisiae, as preliminary analyses for the toxicogenic and antitumor evaluation of citrinin in murine models for Sarcoma 180 and for 7,12-dimethylbenzanthracene induced breast cancer with behavioral, biochemical, histopathological and immunohistochemical (Ki-67) monitoring. The acetonitrile extract and the isolates were characterized by liquid and gas chromatography. Nauplii of A. salina were exposed to the compounds for 24 and 48 hours, and Al. cepa for 72 hours. Oxidative/antioxidant evaluation was performed on pre, co- and post-treatment with H2O2 in S. cerevisiae. Citrinin at concentrations of 0.5; 1.0 and 2.0 μg/ml was incubated for 68 hours in Sarcoma 180 ascitic fluid cells and reincubated for 4h in a stove at 37 °C and 5% CO2 after addition of cell suspension, 20 μl of [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium] (5 mg/mL). Then, 0.5 x 106 cells/mL of the suspension were subjected to alkaline and micronucleus comet tests. Breast cancer in female Mus musculus was induced by 7,12-dimethylbenzanthracene (6 mg/kg, orally). The vehicle was olive oil (10 mL/kg) and citrinin tested at 2 μg/kg-1 , orally, and cyclophosphamide (25 mg/kg-1, intraperitonially) as a positive control. Breast cancer induction occurred within 11 weeks, and citrinin therapy in 3 weeks. In A. salina, the acetonitrile extract, citrinin and dictinin A displayed a toxicity with CL50 (24 hours) of 2.03 μg/mL, 1.71 μg/mL and 2.29 μg/mL, as well as CL50 (48 hours) of 0.51 μg/mL, 0.54 μg/mL and 0.54 μg/mL, respectively. In A. cepa, compounds were cytotoxic by low mitotic index and mutagenic by the increase of micronuclei and chromosomal alterations. The extract and its metabolites were antioxidants against H2O2 in proficient strains of S. cerevisiae only at low concentrations, and mutant for cytoplasmic and mitochondrial superoxide dismutase. CI50 of citrinin in S-180 cells was 3.77 μg/mL, and at concentrations 12.5 and 100 μg/mL it was as cytotoxic as doxorubicin (2 μg/mL). At 0.5, 1.0 and 2.0 μg/mL, it induced genotoxicity and mutagenicity in S-180 cells, especially at 2 μg/mL, due to oxidative damage similar to hydrogen peroxide (10 mM), by mechanisms associated with cytogenetic damage, especially apoptosis. Breast cancer was characterized by invasive mammary carcinoma by immunohistochemistry and histopathological analysis, and citrinin induced genotoxic effects in breast, marrow, lymphocyte and liver cells, and mutagenic by the formation of micronuclei, bridges, buds and binucleate cells in bone marrow bone and liver. We did not observe any changes in organ weights, except for the breasts. There were similar effects of genotoxicity for citrinin and cyclophosphamide, but repair of lymphocyte damage was observed only in therapy with citrinin, which showed antitumor action, by cytogenetic mechanisms, possibly associated with oxidative stress. The bioactive compounds obtained from the acetonitrile extract of P. citrinum are sources for pharmaceutical antitumor formulations.