ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM COMPLEXO DE INCLUSÃO E TESTES DE ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS A PARTIR DE CONSTITUINTE QUE TEM ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICO ISOLADO DAS SEMENTES DE Platonia insignis MART (BACURIZEIRO)

Abstract

RESUMO Platonia insignis MART é uma planta pertencente à família Clusiaceae, popularmente conhecida como bacurizeiro. Extratos de suas sementes são bastante usados na medicina popular para o tratamento de queimaduras, doenças dermatológicas, diarréias e doenças inflamatórias. Possuindo também atividade antioxidante, apresentando, dessa forma, uma possível ação protetora contra o desenvolvimento de processos neurodegenerativos como a doença de Alzeimer (DA). DA está associada a déficits de neurotransmissores cerebrais, como acetilcolina, neurodrenalina e serotonina. O tratamento da DA consiste no restabelecimento da função colinérgica. Neste processo de restauração, a elevação dos níveis de neurotransmissores de acetilcolina pode ser útil para melhorar um dos sinais da doença. Acredita-se que a inibição acetilcolinesterase (AChE), enzima chave na degradação da acetilcolina, aumente a concentração de acetilcolina nas sinapses. Do extrato hexânico das sementes da P. insignis foi isolada a substância, 2-oleil-1,3-dipalmitoil-glicerol (ODG), cujos testes in vitro apresentaram inibição significativa para AChE. Porém, ODG apresenta baixa solubilidade em água, a fim de aumentar a sua solubilidade foi preparado o complexo de inclusão (CI) entre ODG e β-ciclodextrina (β-CD). O propósito desse estudo foi preparar, caracterizar e avaliar a solubilidade e a taxa de dissolução do CI entre ODG e β-CD. O CI foi obtido por solubilização seguido de liofilização e caracterizado por espectroscopia no infravermelho (IV), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG), microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de raios X (DRX) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H). Além disso, foram analisados a isoterma de solubilidade de fases e ensaios de dissolução. Os resultados de IV, DSC, TG, MEV, DRX e RMN 1H sugeriram a formação do CI. De acordo com dados de RMN 1H foi possível prever que a ODG foi encapsulada pelo lado mais largo da cavidade da β-CD. A isoterma de solubilidade permitiu determinar a constante de estabilidade aparente (K = 339,38 L mol-1), a eficiência de inclusão (EI = 57,82%) e a estequiometria molar (1:1). Portanto, o uso de ODG-β-CD pode efetivamente melhorar a solubilidade e a taxa de dissolução da ODG livre, sendo uma abordagem promissora para promover sua aplicação clínica. Adicionalmente foram avaliados os efeitos tóxicos, citotóxicos e mutagênicos de ODG frente a Allium cepa, bem como os efeitos antioxidantes in vitro frente à produção de radicais hidroxila, óxido nítrico e espécies reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS). No ensaio de A. cepa (0,002 – 0,2 mg mL-1), ODG na maior concentração foi ligeiramente tóxico e citotóxico, contudo, em nenhuma das concentrações testadas, ODG revelou efeitos não mutagênicos. Observou-se que ODG (8,75 – 140 μg mL-1) reduz a produção de óxido nítrico em 41,6%, enquanto o ácido ascórbico (AA), padrão antioxidante, reduziu em 54,14%. ODG (15,625 – 250 μg mL-1) promoveu a remoção do radical hidroxila em 35,69% na maior concentração e foi capaz de prevenir a peroxidação lipídica induzida pelo 2,2'-azobis-2-amidinopropano (AAPH), inibindo a quantidade de TBARS, em até 65%, resultado próximo ao obtido com AA (64%). Assim, ODG reduziu moderadamente os níveis de radicais hidroxila e óxido nítrico e inibiu significativamente os níveis de TBARS in vitro. ABSTRACT Platonia insignis MART is a plant belonging to the family Clusiaceae, popularly known as bacurizeiro. Extracts of their seeds are widely used in folk medicine for the treatment of burns, dermatological diseases, diarrhea and inflammatory diseases. Also possessing antioxidant activity, thus presenting a possible protective action against the development of neurodegenerative processes such as Alzeimer's disease (AD). AD is associated with deficits of brain neurotransmitters such as acetylcholine, neurodrenaline and serotonin. The treatment of AD consists in the reestablishment of cholinergic function. In this restorative process, elevation of acetylcholine neurotransmitter levels may be useful to ameliorate one of the signs of the disease. Inhibition of acetylcholinesterase (AChE), a key enzyme in the degradation of acetylcholine, is believed to increase the concentration of acetylcholine at the synapses. From the hexanic extract of P. insignis seeds, 2-oleyl-1,3-dipalmitoyl-glycerol (ODG) was isolated, whose in vitro tests showed significant inhibition of AChE. However, ODG has low solubility in water, in order to increase its solubility, the inclusion complex (IC) between ODG and β-cyclodextrin (β-CD) was prepared. The purpose of this study was to prepare, characterize and evaluate the solubility and dissolution rate of IC between ODG and β-CD. The IC was obtained by solubilization followed by lyophilization and characterized by infrared spectroscopy (IR), differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD) and nuclear magnetic resonance of hydrogen (1H NMR). In addition, the phase solubility isotherm and dissolution tests were analyzed. The results of IR, DSC, TG, SEM, XRD and 1H NMR suggested the formation of IC. According to 1H NMR data it was possible to predict that ODG was encapsulated by the wider side of the β-CD cavity. The solubility isotherm allowed to determine the apparent stability constant (K = 339.38 L mol-1), the inclusion efficiency (EI = 57.82%) and the molar stoichiometry (1:1). Therefore, the use of ODG-β-CD can effectively improve the solubility and dissolution rate of free ODG, being a promising approach to promote its clinical application. In addition, the toxic, cytotoxic and mutagenic effects of ODG against Allium cepa, as well as the in vitro antioxidant effects against the production of hydroxyl radicals, nitric oxide and thiobarbituric acid reactive species (TBARS) were evaluated. In the assay of A. cepa (0.002 – 0.2 mg mL-1), ODG at the highest concentration was slightly toxic and cytotoxic, however, at none of the concentrations tested, ODG revealed non-mutagenic effects. ODG (8.75 – 140 μg mL-1) was found to reduce nitric oxide production by 41.6%, while antioxidant standard ascorbic acid (AA) reduced by 54.14%. ODG (15.625 – 250 μg mL-1) promoted the removal of the hydroxyl radical in 35.69% in the highest concentration and was able to prevent lipid peroxidation induced by 2,2'-azobis-2-amidinopropane (AAPH), inhibiting the amount of TBARS in up to 65%, a result close to that obtained with AA (64%). Thus, ODG moderately reduced hydroxyl and nitric oxide radical levels and significantly inhibited TBARS levels in vitro.