UTILIZAÇÃO DE RNAm DO GENE HSP70 PARA QUANTIFICAÇÃO DE PARASITEMIA DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA

Abstract

RESUMO: A Leishmaniose Visceral (LV) no Brasil é considerada um grave e emergente problema de saúde pública em áreas urbanas de grandes capitais. A LV é causada pelas espécies Leishmania donovani e Leishmania infantum, sua importância deve-se ao fato de assumir formas graves e letais quando o diagnóstico e o tratamento não são eficazes. O diagnóstico representa uma dificuldade para o controle da doença, devido a variações metodológicas. Nesse contexto, os métodos moleculares melhoram a sensibilidade e podem diagnosticar pacientes assintomáticos e imunossuprimidos. A presença de transcritos de RNA vem demonstrando ser um bom biomarcador e campo promissor para a pesquisa de parasitas viáveis em amostras biológicas. Acredita-se que devido à labilidade e à rápida degradação, a quantidade de RNA de parasitas circulantes em sangue periférico do hospedeiro pode ser uma estimativa da parasitemia e um preditor de infecciosidade. A PCR quantitativa de RNA (RT-qPCR) pode determinar o número de parasitas viáveis. O objetivo desta pesquisa foi descrever a presença de RNA de L. infantum em sistema de PCR quantitativa (qPCR) e utilizar o RNAm de leishmania para fins diagnóstico. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada em amostras de sangue de 79 pacientes com calazar admitidos em um hospital de referência em Teresina - PI, Brasil. Foram extraídos DNA e RNA de sangue dos pacientes para posterior quantificação. Os primers foram usados para amplificar kDNA para RNA e DNA, usando o sistema TaqMan; e, para RNA, utilizou como marcador o gene HSP70, usando o sistema SYBR Green. Houve maior quantificação de parasitas para DNA em comparação ao RNA e apresentou correlação positiva (p= 0,03; Rho 0,23). A mediana da estimativa de parasitemia para o RNA foi de 32,5 parasitas/mL e para o DNA a foi de 1380 parasitas/mL. A parasitemia estimada não se mostrou associada à idade, ao gênero, à infecção pelo HIV, à gravidade do quadro clínico ou à morte. O ensaio sorológico de 61/78 pacientes com LVH foram reagentes, apresentando uma sensibilidade de 78% (95% IC: 67; 87) e especificidade de 86% (95% IC: 59; 98). Para os métodos moleculares, para quantificação do DNA por qPCR apresentou 74/79 pacientes positivos com sensibilidade de 94% (95% IC: 86; 98) e especificidade de 100%. Para qRT-PCR utilizando o sistema SYBR Green, 41/79 pacientes foram positivos com sensibilidade de 64% (95% IC: 52; 75) e especificidade de 82% (95% IC: 66; 92). Para qRT-PCR utilizando o sistema Taqman, todos os pacientes foram positivos com sensibilidade de 100% e especificidade de 95% (95% IC: 83; 99). A RT-qPCR demonstrou ser uma técnica promissora e pode ser validada para estimativa da parasitemia e para eventual substituição do xenodiagnóstico para verificação da infecciosidade de reservatórios com calazar. ABSTRACT: The Visceral Leishmaniasis (VL), in Brazil, is considered a severe emergent public health problem in the urban areas of the great cities. The VL is caused by the species Leishmania donovani and Leishmania infantum, and its importance is due to the fact it takes serious and lethal forms when diagnosis and treatment are not efficients. The diagnostic represents an trouble in the sense of disease control, due methodological variations. In this context, molecular methods improve the sensibility and can diagnosticate asymptomatics and immunosuppressed patients. The presence of RNA transcripts have been shown to be a good biomarker and a promissory research field on viable parasites in biological samples. It is believed that due to the lability and the fast degradation, the amount of RNA of circulating parasites in peripheral blood of the host may be an parasitaemia estimate and a infectivity predictor. The quantitative RNA PCR (RT-qPCR)can determinate the number of viable parasites. The objective of this research is to describe the presence of L. infantum's RNA in system of quantitative PRC (qPCR) and to use leishmania mRNA for diagnostic purposes. The quantitative polymerase’s chain reaction was performed in blood samples of 79 kala-azar’s patients addmited on a reference hospital at Teresina, Piauí, Brazil. It were extracted DNA and RNA of the patients for a posterior quantification. The primers were used to amplify kDNA into RNA and DNA, using the TaqMan system; and, for RNA, has utilized, as marker, the HSP70 gene, using the SYBR Green system. There was higher quantification of DNA parasites in comparison to RNA and showed positive correlation (p = 0.03; Rho 0.23). The median estimate of parasitemia for RNA was 32.5 parasites / mL and for DNA a was 1380 parasites / mL. Estimated parasitemia was not associated with age, gender, HIV infection, severity of disease or death. By serological test, 61/78 patients with VL were positive, presenting a sensitivity of 78% (95% CI: 67; 87) and specificity of 86% (95% CI: 59; 98). For qRT-PCR using the SYBR Green system, 41/79 patients were positive with a sensitivity of 64% (95% CI: 52; 75) and specificity of 82% (95% CI: 66; 92). For qRT-PCR using the Taqman system, all patients were positive with 100% sensitivity and 95% specificity (95% CI: 83; 99). The RT-qPCR proved to be a promising technique and can be validated for the estimation of parasitemia and for eventual replacement of xenodiagnosis to verify the infectivity of reservoirs with kala-azar.