EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DOS ÁCIDOS OLÉICO E PALMÍTICO E DO EUGENOL NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN BOVINO

Abstract

RESUMO: Objetivou-se avaliar e comparar as características de qualidade de sêmen criopreservado das raças de touros, Nelore e Curraleiro Pé-Duro, como também os efeitos da suplementação de diferentes concentrações de ácido oleico (50μM e 100μM), ácido palmítico (50μM e 100μM), e eugenol (10μM e 50μM), no diluidor TRIS-gema para a criopreservação de espermatozoides Curraleiro Pé-Duro. Foram utilizados vinte ejaculados de quatro touros Curraleiro Pé-Duro, e vinte ejaculados de quatro touros Nelore, após as coletas o sêmen foi diluído em TRIS-Gema e separado de acordo com cada raça e seus respectivos tratamentos. Posteriormente as amostras foram envasadas em palhetas de 0,25ml e criopreservadas. As palhetas foram mantidas em equilíbrio por 60 minutos a 5ºC, para então serem criopreservadas em protocolo padrão de criopreservação com uso da máquina TK 3000®, e armazenadas em botijão criogênico. Após 30 dias foram realizadas as análises pós-criopreservação. As avaliações espermáticas incluíram os testes de termorresistência, integridade e funcionalidade das membranas espermáticas, cinética espermática, morfologia, quantificação da lipoperoxidação espermática, quantificação de glutationa reduzida (GSH), e teste de fertilidade in vitro. Observou-se que a raça Curraleiro Pé Duro apresentou melhores resultados para morfologia espermática e quantificação de MDA, enquanto que a raça Nelore obteve melhores taxas de fertilização. A suplementação de 100 μM de ácido palmítico aumentou o percentual de linearidade e WOB dos gametas, no entanto reduziu a ALH. Foi observado redução na membrana acrossomal intacta no grupo controle, quando incubados a 180 minutos e comparados ao tempo de 60 minutos. O ácido palmítico a 50 μM reduziu as membranas plasmática íntegras no tempo de 180 minutos comparado ao tempo 0 minutos. A quantidade de MDA foi menor nos tratamentos com ácido palmítico a 50 μM e 100 μM e ácido oleico 50 μM, quando comparado ao grupo controle. A atividade da enzima Glutationa reduzida (GSH) foi elevada em meio com ácido palmítico 50 μM e 100 μM e ácido oleico 100 μM, quando comparados ao controle. Os diferentes tratamentos não influenciaram na taxa de clivagem. Quanto a suplementação de eugenol as concentrações de 50μM diferiu significativamente (p<0,05) dos demais tratamentos, induzindo um aumento na quantificação de GSH, uma redução na determinação de MDA, um aumento no VSL, preservando a integridade das membranas plasmática e acrossomal. Em conclusão, o sêmen criopreservado da raça Curraleiro Pé Duro se mostrou viável ao processo de criopreservação, com baixas alterações morfológicas de peça intermediária e reduzido estresse oxidativo. A suplementação de 100 μM de ácido palmítico ao diluidor TRIS-Gema, preservou a viabilidade do sêmen criopreservado de bovino, e o Eugenol foi eficiente em reduzir o estresse oxidativo espermático, além de preservar a integridade da membrana acrossomal ao longo do tempo de incubação, sem, no entanto, melhorar nenhum dos parâmetros cinéticos avaliados. ABSTRACT: The objective of this study was to evaluate and compare quality characteristics of cryopreserved bulls semen, Nelore and Curraleiro Pé-Duro breeds, and effects of different concentrations of oleic acid (50μM and 100μM), palmitic acid (50μM and 100μM), and eugenol (10μM and 50μM) supplementations, in TRIS-Gema extender of Curraleiro Pé-Duro sperm cryopreservation. Twenty ejaculates from four Curraleiro Pé-Duro bulls and twenty ejaculates from four Nelore bulls were used. After collection the semen was diluted in TRIS Gem and separated according to each breed and their respective treatments. Subsequently samples were filled into 0.25 ml straws and cryopreserved. The pellets were maintained in equilibrium at 5 ° C for 60 minutes, to then be cryopreserved in standard cryopreservation protocol using TK 3000® machine, to then be stored in cryogenic cylinder. After 30 days post-cryopreservation analyzes were performed. Sperm evaluations included thermoresistance, integrity and functionality tests of spermatic membranes, spermatic kinetics, morphology, quantification of sperm lipoperoxidation, quantification of reduced glutathione (GSH), and in vitro fertility test. It was observed that CPD breed presented better results for sperm morphology and quantification of MDA, while Nelore breed obtained better fertilization rates. Palmitic acid supplementation of 100 μM increased percentage of linearity and WOB of gametes, however it reduced HLA. Reduction in intact acrosome membrane presented in control group was observed when incubated at 180 minutes and compared when incubated at 60 minutes. Palmitic acid at 50 μM reduced intact plasma membrane at 180 minutes compared to the time at 0 (zero) minutes. The amount of MDA was lower in treatments with 50 μM and 100 μM palmitic acid and 50 μM oleic acid when compared to control group. Reduced Glutathione (GSH) activity was increased in medium with 50 μM and 100 μM palmitic acid and 100 μM oleic acid when compared to control. Different treatments did not influence the rate of cleavage. As regards eugenol supplementation, concentrations of 50 μM differed significantly (P <0.05) from others treatments, inducing an increase in GSH quantification, a reduction in MDA determination, an increase in VSL, preserving plasma and acrosome membranes integrity. In conclusion, cryopreserved semen of Curraleiro Pé Duro breed proved viable to cryopreservation process, with low morphological alterations of intermediate part and reduced oxidative stress. The supplementation of 100 μM palmitic acid to TRIS-Gema diluent preserved viability of cryopreserved bovine semen and Eugenol was efficient in reducing sperm oxidative stress and preserving the integrity of acrosomal membrane throughout incubation time, without, however, improving any of the kinetic parameters evaluated.