FOSFOPROTEÔMICA EM PODÓCITO HUMANO IMORTALIZADO DA DOENÇA DE FABRY DESENVOLVIDO UTILIZANDO A TECNOLOGIA CRISPR/CAS9

Abstract

RESUMO: A Doença de Fabry (DF) é uma doença rara de acúmulo lisossômico com padrão de herança ligado ao cromossomo X. A DF é ocasionada por mutações no gene GLA que codifica a enzima alpha-galactosidase A (-GAL A), cuja principal função é metabolizar glicoesfingolipídeos. A Terapia de Reposição Enzimática (TRE) melhorou a qualidade de vida dos pacientes com DF, mas não impede a progressão da Nefropatia de Fabry (NF). A Doença Renal Crônica (DRC) é uma das principais causas de morbidade, redução da qualidade de vida e morte prematura em pacientes portadores da DF. O globotriaosilceramida (Gb3), o principal substrato de -GAL A, se acumula progressivamente dentro das células em uma variedade de tecidos. Os mecanismos pelos quais o aumento dos níveis de Gb3 e seus metabólitos secundários resultam em disfunção celular e orgânica na DF ainda permanecem desconhecidos. O estabelecimento de modelos celulares tem sido uma ferramenta útil para testar hipóteses de patogênese, para identificar biomarcadores de prognóstico clínico e de progressão da doença e para o desenvolvimento de medicamentos em fase inicial para várias doenças humanas. Objetivos: Identificação de vias de sinalização alteranas em podócito humano imortalizado com o genótipo e fenótipo da DF. Metodologia: Nós utilizamos a tecnologia de edição gênica Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats associated endonuclease 9 (CRISPR/Cas9) para desenvolver um modelo de podócito humano imortalizado da DF. Em seguida, realizamos um estudo exploratório das vias de sinalização alteradas no modelo de podócito da DF em relação ao podócito controle utilizando como abordagem o fosfosarray. Resultados: Nosso modelo de podócito humano da DF apresentou elevados níveis de Gb3 e atividade de -GAL A reduzida. O estudo exploratório identificou um total de 59 proteínas e fosfoproteínas diferencialmente expressas. O estudo de ontologia gênica mostrou que essas proteínas estão envolvidas nos processos de crescimento, diferenciação e regulação do ciclo celular através das vias de sinalização PI3K, AKT, ErbB e MAPK. Conclusão: Este estudo fornece pela primeira vez uma análise abrangente das vias de sinalização na deficiência de -GAL A em podócitos humano imortalizados da DF e potencialmente abre novos caminhos para descoberta de biomarcadores e desenvolvimento de fármacos para a NF. ABSTRACT: Fabry disease (FD) is a rare X-linked lysosomal storage disorder. Recent newborn screening data estimate that over 1,300 patients are born with FD each year. Over 70% of FD patients present with kidney dysfunction, of which about half progresses to end stage renal disease. While enzyme replacement therapy (ERT) has improved quality of life of FD patients, the kidney shows only suboptimal response to therapy, and disease progression can occur despite long term ERT. Globotriaosylceramide (Gb3), the main substrate of α-gal A, progressively accumulates in a variety of tissues, and at the cellular level, it localizes to lipid raft domains. The mechanisms by which increased levels of Gb3 result in cellular and organ dysfunction in F are still unknown. Establishment of cell models have been useful as a tool for testing hypotheses of disease pathogenesis, for identifying biomarkers of clinical prognosis and disease progression, and for high-throughput early stage drug development for several human diseases. Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated endonuclease (Cas)9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) represent a novel tool for single or multiple genes modification in replicating cells, capable of inducing frame-shift insertion/deletion mutations and subsequent gene disruption. We applied CRISPR/Cas9 genome editing technology to develop human kidney cell models of FD in immortalized podocytes Using a surrogate reporter plasmid and selection through flow cytometry assisted sorting and hygromycin resistance, we enriched cell populations that were potentially modified through transfection of CRISPR plasmids designed to target different regions of the GLA gene. Enriched cell populations showed editing of target region through T7E1 assay as well as phenotype of FD shown by accumulation of the Gb3 and decreased enzyme activity of α-gal A. Single clonal cell populations were characterized for genome editing of GLA by sequencing of PCR amplified regions. In order to explore different pathways that could have distinct patterns of activation under condition of α-gal A deficiency in podocyte, we performed a phosphorylation profiling of immortalized human podocytes which were genome edited for FD and compared to control cells. Using a high-throughput antibody array, we measured the differential fold change for each total protein as well as their phosphorylation status per site in FD and control podocytes. Our results point at canonical pathways such as PI3K/AKT and ERK/MAPK as being differentially activated in FD podocytes. This study provides for the first time a comprehensive analysis of signaling pathways in α-gal A deficiency and potentially opens new avenues for biomarker discovery and drug development for Fabry nephropathy.