DESENVOLVIMENTO DE UM PRODUTO BIOTECNOLÓGICO À BASE DE GOMA DO CAJUEIRO (Anacardium occidentale L.) E QUITOSANA COMO SUPORTE PARA CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

Abstract

RESUMO: A bioengenharia de tecidos envolve o uso de materiais biocompatíveis e biodegradáveis que atuam como matrizes utilizadas para o crescimento celular, denominadas scaffolds. A utilização de polímeros naturais na produção de scaffolds tem se mostrado promissora, uma vez que apresentam menor risco de rejeição quando implantados in vivo, além de apresentarem adesão celular mais eficiente quando comparados à materiais sintéticos. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um scaffold utilizando como matérias-primas a quitosana e a goma de cajueiro (Anacardium occidentale L.) modificada com anidrido ftálico (GCAF), e testá-lo in vitro em cultura de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (CTMPDh). As CTMPDh foram isoladas, expandidas e caracterizadas quanto ao potencial de diferenciação nas linhagens mesenquimais e quanto ao perfil imunofenotípico para serem utilizadas nos testes in vitro. O scaffold foi fabricado utilizando a quitosana e a GCAF em iguais proporções e utilizando a técnica de congelação/liofilização. As CTMPDh foram cultivadas nos scaffolds durante 7 dias. Para avaliação da adesão e crescimento celular, técnicas histológicas e de microscopia eletrônica de varredura foram utilizadas. O potencial de citotoxicidade foi analisado através dos testes de MTT e atividade hemolítica do scaffold e das soluções de quitosana e GCAF separadamente. Para avaliação da atividade imunomoduladora, foram realizados os testes de atividade fagocítica e óxido nítrico do scaffold e da solução da GCAF em diferentes concentrações. O tamanho dos poros do scaffold foram analisados através da MEV. Para caracterização do scaffold foram realizados testes de intumescimento, FT-IR, DRX e TGA. As CTMPDh isoladas apresentaram morfologia fibroblastóide, capacidade de aderência ao plástico, diferenciação nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica, e expressão positiva para o marcador de superfície CD105 e negativa para CD14 e CD45. As CTMPDh semeadas sobre o scaffold fabricado apresentaram morfologia típica, fixação e distribuição adequada pelo interior dos poros da matriz. A citotoxicidade da GCAF pelo método de MTT e hemolítico apresentaram CC50 e CH50 superiores a 1000 μg/ml-1. A avaliação da capacidade fagocítica sobre o scaffold fabricado demonstrou ativação superior das células em todas as concentrações da goma testadas, indicando que a matriz fabricada apresenta potencial de biodegradabilidade. Houve um leve aumento na síntese do óxido nítrico até a concentração de 400 μg/ml-1 da GCAF. O teste de MTT realizado com scaffold sobre as CTMPDh após 24 e 48h, demonstrou viabilidade reduzida, provavelmente, em virtude da migração das células para o interior dos poros do scaffold desenvolvido. A taxa de intumescimento do scaffold foi de 96,4%, apresentando poros com tamanho entre 73 à 124 μm. A técnica de DRX mostrou que o scaffold desenvolvido apresentou maior cristalinidade devido apresentar picos mais definidos em sua estrutura. A TGA mostrou que o scaffold produzido apresentou temperatura de decomposição maior que os polissacarídeos usados para sua fabricação A utilização de scaffolds fabricados com GCAF e quitosana apresenta aplicabilidade para cultivo celular in vitro funcionando como uma matriz de suporte para o crescimento destas células, surgindo como um importante biomaterial a ser utilizado como suporte e meio de transporte de células em processos de regeneração tecidual. ABSTRACT: Tissue bioengineering involves the use of biocompatible and biodegradable materials that act as matrices used for cell growth, called scaffolds. The use of natural polymers in the production of scaffolds has shown to be promising, since they present a lower risk of rejection when implanted in vivo, besides presenting more efficient cellular adhesion when compared to synthetic materials. The objective of this research was to develop a scaffold using chitosan and cashew gum (Anacardium occidentale L.) modified with phthalic anhydride (GCAF) as raw materials and to test it in vitro in mesenchymal stem cell culture of the dental pulp (CTMPDh). The CTMPDh were isolated, expanded and characterized as to the potential differentiation in the mesenchymal lineages and the immunophenotypic profile to be used in the in vitro tests. Scaffold was manufactured using chitosan and GCAF in equal proportions and using the freeze / lyophilization technique. CTMPDh were grown on the scaffolds for 7 days. To evaluate cell adhesion and growth, histological and scanning electron microscopy techniques were used. The potential for cytotoxicity was analyzed by MTT tests and hemolytic activity of scaffold and chitosan and GCAF solutions separately. To evaluate the immunomodulatory activity, the tests of phagocytic activity and nitric oxide of the scaffold and of the GCAF solution were performed in different concentrations. The pore size of the scaffold was analyzed through SEM. To characterize the scaffold, swelling, FT-IR, XRD and TGA tests were performed. Isolated CTMPDh showed fibroblastode morphology, plastic adhesion capacity, differentiation in the osteogenic, adipogenic and chondrogenic lines, and positive expression for CD105 and CD45 negative surface markers. CTMPDh seeded on the fabricated scaffold exhibited typical morphology, fixation, and adequate distribution through the interior of the matrix pores. The cytotoxicity of GCAF by the MTT and hemolytic method showed CC50 and CH50 greater than 1000 μg / ml-1. The evaluation of the phagocytic capacity on the fabricated scaffold demonstrated superior activation of the cells at all concentrations of the gum tested, indicating that the fabricated matrix has biodegradability potential. There was a slight increase in the synthesis of nitric oxide up to the concentration of 400 μg / ml -1 of GCAF. The MTT test performed with scaffold on the CTMPDh after 24 and 48h demonstrated reduced viability, probably due to the migration of the cells into the pores of the developed scaffold. The scaffold swelling rate was 96.4%, with pores ranging in size from 73 to 124 μm. The XRD technique showed that the scaffold developed showed higher crystallinity due to more defined peaks in its structure. The TGA showed that the scaffold produced had a higher decomposition temperature than the polysaccharides used for its manufacture. The use of scaffolds made with GCAF and chitosan presents applicability for in vitro cell culture functioning as a support matrix for the growth of these cells, appearing as a Important biomaterial to be used as support and means of transporting cells in tissue regeneration processes.