AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DOS EFEITOS TOXICOLÓGICOS AGUDOS E ANSIOLÍTICOS DA RIPARINA A E COMPLEXAÇÃO COM β-ciclodextrina.

Abstract

RESUMO A N-(2-feniletil)benzamida ou riparina A (Rip-A) consiste em um derivado sintético das riparinas naturais extraídas da Aniba riparia (Nees) Mez, amidas caracterizadas por possuírem relevante atividade central. A presente tese buscou realizar a avaliação pré-clínica da toxicidade aguda e atividade ansiolítica da riparina A, assim como, obter e caracterizar o complexo de inclusão da referida substância com betaciclodextrina (β-CD). Foi realizada a síntese da riparina A mediante a reação de Schotten-Bauman seguido da execução do teste agudo de classe da Organization for Economic Cooperation and Devevolpment, diretriz n° 423 e avaliação dos seus efeitos bioquímicos, hematológicos e histopatológicos nas doses de 300 e 2000 mg kg-1em camundongos adultos linhagem Swiss. Procedeu-se com a investigação da atividade ansiolítica da Rip-A nos modelos animais clássicos do labirinto em cruz elevado (LCE), caixa claro-escuro (TCE) e do teste de esconder esferas (TEE) nas doses de 50, 100 e 200 mg kg-1 seguido da elucidação das interações envolvidas com receptor farmacológico GABAA mediante estudo de docagem molecular. Por fim, foi obtido o complexo de inclusão Rip-A/β-CD por spray-drying, caracterizando-o através de diagrama de solubilidade de fases de Higuchi e Connors, estudo de solubilidade, análise térmica por calorimetria exploratória diferencial (CED), difração de raios X (DRX), espectroscopia de infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), além da verificação comparativa da atividade citotóxica artemicida da Rip-A isolada e do complexo de inclusão. O tratamento agudo com a Rip-A não causou sinais de toxicidade no screening hipocrático e não provocou mortes. A substância foi classificada como categoria 5, segundo Globally Harmonised System, com baixa toxicidade e DL50 superior a 2000 mg kg-1. Houve elevação nos níveis de triglicerídeos e alterações histopatológicas no fígado e nos rins dos roedores envolvidos no estudo de toxicidade, com presença de degeneração hidrópica, esteatose, congestão vascular e trombos em ambos os grupos tratados e ausência de alterações hematológicas. A atividade ansiolítica foi preponderante com a dose de 200 mg kg-1 com elevação no tempo de permanência nos braços abertos do LCE, aumento no número de transições entre os compartimentos no TCE e redução no total de esferas escondidas no TEE. O estudo in silico indicou que a Rip-A interage em sítio de ligação que envolve a subunidade β1 do receptor GABAA com participação do resíduo de aminoácido Tyr87, diferentemente do diazepam. A complexação, por sua vez, mostrou-se mais eficaz com a metodologia da secagem por aspersão o que gerou aumento da hidrossolubilidade da Rip-A e diagrama de solubilidade do tipo AL. A complexação foi constatada pela redução do pico endotérmico a 116,2°C na curva de CED, redução do sinal de ângulo 2θ em 12,6° na análise por DRX, redução dos picos a 1544 cm-1, 2850 cm-1 e 3344 cm-1 na análise por IV e variação do deslocamento químico do H3 da β-CD no espectro de RMN 1H. O complexo tem morfologia distinta do aspecto cristalino da Rip-A livre e apresentou superior atividade artemicida (CI50 de 117,2 μg mL-1) devido melhor solubilidade da preparação. Os resultados obtidos corroboram a baixa toxicidade e a ação central da Rip-A, além de abrirem perspectivas para novas pesquisas nas áreas de farmacologia e de tecnologia farmacêutica com as riparinas complexadas. -----------------ABSTRACT N-(2-phenylethyl) benzamide or riparin A (Rip-A) consists of a synthetic derivative of the natural riparins extracted from Aniba riparia (Nees) Mez. These amides are characterized by having relevant central activity. The present thesis aimed to perform the preclinical evaluation of the acute toxicity and anxiolytic activity of Rip-A, and the obtention and characterization of the inclusion complex formed by this substance and beta-cyclodextrin (β-CD). The synthesis of Rip-A was made by the Schotten-Bauman reaction followed by the performance of the acute class test from the Organization for Economic Cooperation and Development, Guideline No. 423. It was evaluated the biochemical, hematological and histopathological effects at the doses of 300 and 2000 mg kg-1 in adult mice of Swiss strain. Then, it was made the investigation of Rip-A anxiolytic activity by the elevated plus maze test (EPM), light/dark box test (LDB) and marble burying test (MB). These tests were made at the doses of 50, 100 and 200 mg kg-1 followed by elucidation of the interactions involved with the pharmacological receptor GABAA through molecular docking study. Finally, it was obtained the Rip-A/β-CD inclusion complex by spray drying. Its characterization was made by phase solubility diagram of Higuchi and Connors, dissolution profile, differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD), Infrared spectroscopy (IR), Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR), and Scanning Electron Microscopy (SEM). In addition, it was made a comparative verification of the artemicidal property of the isolated Rip-A and the inclusion complex. The acute treatment with Rip-A showed no signs of toxicity in the hippocratic screening and caused no deaths. The substance was classified as category 5, according to the Globally Harmonized System, with low toxicity and LD50 above 2000 mg kg-1. There were elevations in triglyceride levels and histopathological alterations in the liver and kidneys of the mice involved in the toxicity study. It was found hydropic degeneration, steatosis, vascular congestion and thrombi in both treated groups and absence of hematological alterations. The anxiolytic activity was predominant at the dose of 200 mg kg-1 with increase of the time spent in the open arms of EPM, increase in the number of transitions between compartments of the LDB, and decrease in the number of hidden spheres in the MB. The in silico study indicated that the Rip-A interacts at a binding site that involves the β1 subunit of the GABAA receptor with participation of the Tyr87 amino acid residue, unlike diazepam. The complexation was shown to be more efficient by the spray-drying methodology, which increased the water solubility of Rip-A with type solubility diagram AL. The complexation was confirmed by reduction of the endothermic peak at 116.2 °C in the DSC curve, reduction of the angle signal 2θ in 12.6° in the XRD analysis, reduction of the peak at 1544 cm-1, 2850 cm1 and 3344 cm-1 in the IR analysis, and variation of chemical displacement in H3 of β-CD in the 1H NMR spectrum. The complex presented distinct crystalline morphology of free Rip-A and higher artemicidal activity (CI50 of 117.0 μg mL-1) due to its better solubility. The obtained results confirm the low toxicity and the central action of Rip-A. These findings create prospects for new research in the areas of pharmacology and pharmaceutical technology with the complexed riparins.