INVESTIGAÇÃO DE FLAVIVÍRUS EMERGENTES E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Dengue virus CIRCULANTES NO ESTADO DO PIAUÍ

Abstract

RESUMO:Os arbovírus são vírus transmitidos por vetores artrópodes e podem infectar seres humanos e animais. Esses vírus constituem um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, resultando em elevadas taxas de morbidade e mortalidade. Produzem diferentes manifestações clínicas, que variam de doença febril a formas graves, incluindo alterações hemorrágicas e neurológicas. Em 2015, nove arbovírus que causam doenças em humanos circularam no Brasil, entre eles destacam-se o Dengue virus (DENV), West Nile virus (WNV) e Saint Louis encefalite virus (SLEV). Recentemente a emergência do Zika virus (ZIKV) e Chikungunya virus (CHIKV) causando doenças exantemáticas, tem dificultado o diagnóstico laboratorial destes arbovírus. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi detectar através de métodos moleculares os Flavivírus associados a doenças exantemáticas e caracterizar geneticamente os sorotipos do Dengue virus, circulantes no estado do Piauí durante o período de 2014-2015. Neste período, foram analisadas 114 amostras de soro e 14 amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com suspeita clínica de dengue ou outras arboviroses cedidos por laboratórios públicos e privados, localizados no estado do Piauí. O RNA viral (vRNA) foi extraído e convertido em DNA complementar (cDNA) através da técnica de Transcrição Reversa (RT) com o uso de iniciadores aleatórios. Na amplificação dos produtos foram analisadas três regiões de interesse distintas: os genes C/prM, E e NS5, em seguida quatro amostras de pacientes com sinais e sintomas de gravidade foram purificadas e sequenciadas pelo método de Sanger (1977), sendo que as sequências obtidas foram alinhadas e comparadas quanto ao grau de identidade com sequências depositadas no GenBank. Uma árvore filogenética foi construída através do programa Mega v.6.0, por análise de Máxima Verossimilhança a partir do gene E, que possui altas taxas de recombinação, resultando no surgimento de variantes a partir de genótipos e linhagens, que podem estar associados ao desenvolvimento de formas graves e análises dessa região permitem acompanhar a evolução viral. O gene NS5 consiste em uma região altamente conservada entre os Flavivírus, o que permite monitorar a sua inserção em determinada região geográfica. Das amostras analisadas por RT-PCR, 22 amostras de soro foram positivas e as do líquido cefalorraquidiano (LCR) não amplificaram. Este estudo identificou a circulação dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-3 no Piauí, o que reflete a situação de hiperendemicidade no estado. Análises filogenéticas do DENV-1 confirmaram a circulação do genótipo V, que é o único descrito no Brasil até o momento e encontra-se distribuído nas Américas, África ocidental e Ásia. Estas análises indicam a detecção de duas linhagens distintas: linhagem 1 (PI-279), que corresponde a isolados da Venezuela, Colômbia e do Brasil e a linhagem 6 (PI-52), que inclui amostras isolada das Ilhas Virgens e a maioria das amostras Brasileiras. Essa relação com países da América Latina reforça a hipótese que estes vírus possam ter sido introduzidos no Brasil através da rota Caribenha, a qual é conhecida como uma importante via de entrada de novos vírus na América do Sul, incluindo o Brasil. A partir da cocirculação dos diferentes arbovírus, entre eles o quatros sorotipos do DENV, o WNV associado à primeira infecção em humanos no país em 2014 e o ZIKV responsável por um surto de doenças exantemáticas no Nordeste Brasileiro em 2015, o nosso grupo de pesquisa padronizou uma RT-PCR para detecção de ZIKV, DENV 1-4 e SLEV a partir de regiões do gene E e NS5. Estudos complementares baseados no diagnóstico diferencial de arbovírus associados a doenças exantemáticas e caracterização molecular dos Flavivírus circulantes são essenciais para o estabelecimento de medidas preventivas em regiões hiperendêmicas, como o estado do Piauí.

ABSTRACT:Arboviruses are viruses transmitted by arthropod vectors and can infect humans and animals. These viruses are a serious public health problem in Brazil and worldwide, resulting in high rates of morbidity and mortality. They produce different clinical manifestations, ranging from febrile illness to severe forms, including hemorrhagic and neurological disorders. In 2015, nine arboviruses that cause disease in humans have been circulating in Brazil, among them stand out from the Dengue virus (DENV), West Nile virus (WNV) and Saint Louis virus encephalitis (SLEV) and recently the emergence of Zika virus (ZIKV) and Chikungunya virus (CHIKV) causing rash illnesses has hindered the laboratory diagnosis of these arboviruses. The aim of this study is to detect Flavivirus associated with rash diseases by molecular methods and genetically characterize the serotypes of Dengue virus circulating in the state of Piauí during the period 2014-2015. 114 serum samples were analyzed as well as 14 cerebrospinal fluid samples (CSF) of patients with clinical suspicion of dengue or other arboviruses granted by public and private laboratory, located in the state of Piaui. The viral RNA (vRNA) was extracted and converted to cDNA by reverse transcription technique (RT) using random primers. In the amplification products were analyzed three regions of distinct interest: the genes C/prM, E and NS5, then four samples from patients with signs and symptoms of gravity were purified and sequenced by the Sanger method (1977) the sequences obtained were aligned and compared by the degree of identity with sequences deposited in GenBank. A phylogenetic tree was constructed using the Mega v.6.0 software for analysis Maximum Likelihood from the E gene, which has high recombination rates, resulting in the emergence of variants from genotype and strains that may be associated with the development of severe disease, and analysis of the region allows the monitoring of viral evolution. The NS5 gene is a highly conserved region among Flaviviruses, which allows the evaluation of their insertion in a particular geographic region. From the samples analyzed by RT-PCR, 22 serum samples were positive and cerebrospinal fluid (CSF) did not amplify. This study identified the circulation of serotype DENV-1, DENV-2 and DENV-3 in Piaui, reflecting the hyperendemicity situation in the state. Phylogenetic analyzes of DENV-1 confirmed the circulation of genotype V, which is the one described in Brazil to date and is distributed in the Americas, West Africa and Asia. These analyzes indicate the detection of two distinct lines: line 1 (PI-279), corresponding to isolates from Venezuela, Colombia and Brazil and line 6 (PI-52), including isolated samples of the Virgin Islands and most Brazilian samples. This relation with Latin America reinforces the hypothesis that these viruses may have been introduced in Brazil through the Caribbean route, which is known as an important new virus entry via South America, including Brazil. From the co-circulation of different arboviruses, including the four serotypes of DENV, WNV associated with the first human infection in the country in 2014 and ZIKV responsible for an outbreak of rash in Northeast Brazil in 2015, our research group has standardized one RT-PCR to detect ZIKV, DENV 1-4 and SLEV from E and NS5 regions of the gene. Further studies based on the differential diagnosis of arbovirus associated with rash diseases and molecular characterization of circulating Flavivirus are essential for the establishment of preventive measures in highly endemic areas, such as the state of Piaui.