INTERAÇÃO IN VITRO DOS MEIOS DE CULTIVO GLUTAMINA ADITIVADO E FOLICULAR OVARIANO SOBRE A CINÉTICA E PLASTICIDADE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CAPRINAS

Abstract

RESUMO: As células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam maior plasticidade, dentre as linhagens de células-tronco somáticas (CTS), originando tecidos mesodermais e não mesodermais. A medula óssea é um dos principais sítios anatômicos para sua obtenção, embora possam ser obtidas de tecidos pós-natais. Em decorrência da multipotencialidade das CTM, sugere-se alto potencial para uso em terapia celular e gênica, assim, tem sido propostos co-cultivos com outras linhagens celulares. Para obter êxito em co-cultivos in vitro é necessário fornecer às células, geneticamente distintas, um meio de desenvolvimento composto que forneça condições de desenvolvimento para ambas linhagens. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre o meio de cultivo padrão para células-tronco e o meio de cultivo de folículos ovarianos, combinados em concentrações g1: 100%/0%, g2: 70%/30%, g3: 50%/50%, g4: 30%/70%, respectivamente, mediante avaliação da curva de crescimento e da capacidade de diferenciação celular. Para tanto, foi utilizado um caprino, macho, com idade de um ano, hígido como doador. O animal foi preparado cirurgicamente e a medula óssea foi coletada através do fêmur. O aspirado medular foi isolado por gradiente de densidade, avaliadas a viabilidade e morfologia celular e as CTM foram expandidas até a terceira passagem, sendo imediatamente criopreservadas. Após seis meses, as células foram descongeladas, expandidas, divididas em quatro grupos cultivados com diferentes meios e submetidas aos ensaios de unidade formadora de colônia fibroblastóide, diferenciação (osteogênica, adipogênica e condrogênica) e cinética celular por curva de crescimento por saturação. Em todos os tratamentos utilizados foi observada a capacidade de formar colônias. As diferenciações foram certificadas pela observação de alterações morfológicas e coloração característica semelhantes aos fenótipos de osteoblastos, adipócitos e condrócitos em todos os grupos. O desempenho das células em curva de crescimento, observado nos quatro grupos, revelou uma fase lag curta, seguida de um crescimento exponencial na fase log, ausência de plateau e finalizado pela fase de declínio ou morte. Onde os grupos 1, 2, 3 e 4 apresentaram curva de crescimento com média de 83,1x103±13,5; 98,2x103±13,1; 72,4x103±14,1 e 48,2x103±13,0 células/mL por poço, respectivamente, ao longo de 21 dias de cultivo. Os achados inferiram que o tratamento utilizado no grupo 2 apresentou o melhor resultado quanto à cinética de CTM caprinas. Além disso, as diferentes concentrações entre os dois meios foram capazes de manter a clonogenicidade das células, assim como a plasticidade celular, sendo a última demonstrada pelas diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica. ABSTRACT: The mesenchymal stem cells (MSC) present greater plasticity, among somatic stem cells (STC) lineages, originating mesodermal and non-mesodermal tissues. Bone marrow is one of the major anatomical sites for its obtainment, although it can be obtained from postnatal tissues. Due to the multipotentiality of MSC, it is suggested a high potential for use in cell and gene therapy, thus, co-cultures with other cell lineages have been proposed. To succeed in in vitro co-cultures it is necessary to provide the cells, genetically distinct, a compound development medium which provides developmental conditions for both lineages. The objective of this work was to evaluate the interaction between the standard culture medium for stem cells and the culture medium of ovarian follicles, combined in concentrations g1: 100%/0%, g2: 70%/30%, g3: 50%/50%, g4: 30%/70%, respectively, by evaluation of growth curve and differentiation ability cell. Therefore, a goat, male, one year old, healthy, was used as donor. The animal was surgically prepared and the bone marrow was collected through the femur. The medullary aspirate was isolated by density gradient, cell viability and morphology were evaluated and the MSC were expanded until the third passage, being immediately cryopreserved. After six months, the cells were thawed, expanded, divided into four groups cultivated with different mediums and submitted to fibroblast colony forming unit assays, differentiation (osteogenic, adipogenic and chondrogenic) and kinetic cellular by saturation growth curve. In all used treatments the ability to form colonies was observed. Differentiations were certified by observation of morphological changes and characteristic coloration similar to osteoblast, adipocyte and chondrocyte phenotypes in all groups. The performance of cells in growth curve, observed in the four groups, revealed a short lag phase, followed by an exponential growth in the log phase, absence of plateau and ended by the decline or death phase. Where the groups 1, 2, 3 and 4 presented a growth curve with mean of 83,1x103±13,5; 98,2x103±13,1; 72,4x103±14,1 and 48,2x103±13,0 cells / mL per well, respectively, over 21 days of cultivation. The findings inferred that the treatment used in group 2 presented the best result regarding the kinetics of goat MSC. In addition, the different concentrations between the two media were able to maintain cell clonogenicity, as well as cellular plasticity, the latter being demonstrated by the osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiations.