ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DOS ALCALOIDES DAS FOLHAS DE PILOCARPUS MICROPHYLLUS ISOLADOS E EM COMBINAÇÃO COM FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS

Abstract

RESUMO: As infecções fúngicas têm papel importante na morbimortalidade humana. Apesar disso, pesquisas que visam o desenvolvimento de terapias ou fármacos mais seguros e efetivos ainda estão defasadas quando comparadas com as doenças causadas por outros patógenos. Dentre as infecções causadas por fungos podem-se citar a cromoblastomicose e a ceratite fúngica filamentosa. A primeira é uma doença polimorfa que ocorre, pela implantação traumática transcutânea de fungos dematiáceos. A última é uma infecção ocular em que ocorre ulceração supurativa da córnea e que pode levar à cegueira. Ambas doenças apresentam número crescente de casos refratários aos tratamentos utilizados. Deste modo, se faz necessária a busca por novas moléculas, bem como a otimização da farmacoterapia atual. Os vegetais são fontes importantes e promissoras de novos fármacos. A espécie Pilocarpus microphyllus, popularmente conhecida como „jaborandi‟, é uma planta nativa das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Vários alcaloides foram isolados das folhas dessa planta, dentre eles, a pilocarpina e a epiisopiloturina, as quais apresentam atividades farmacológicas descritas na literatura. Porém, carecem de análise no que se refere à atividade antifúngica. Esse trabalho objetivou avaliar a susceptibilidade fúngica aos alcaloides obtidos a partir das folhas do jaborandi, através de ensaios in vitro, bem como verificar o efeito da interação desses compostos com agentes antifúngicos. Inicialmente, foi realizada uma prospecção de atividade antifúngica com os alcaloides pilocarpina, isopilocarpina, epiisopilosina, isopilosina e pilosina contra fungos patogênicos (n = 10), incluindo representantes de dermatófitos, agentes da cromoblastomicose e da esporotricose, bem como isolados dos gêneros Aspergillus, Candida e Cryptococcus. A partir destes resultados, o cloridrato de pilocarpina foi selecionado para que fosse avaliado seu efeito em combinação com a terbinafina contra estes mesmos representantes fúngicos e contra agentes da ceratite fúngica filamentosa (n = 8). A epiisopiloturina foi também avaliada quanto à atividade antifúngica, bem como a sua associação com quatro fármacos antifúngicos (itraconazol, posaconazol, terbinafina e anfotericina B) frente a agentes da cromoblastomicose (n = 19). Os testes de susceptibilidade foram realizados de acordo com os métodos de microdiluição propostos nos protocolos M27-A3 e M38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute. As interações dos alcaloides com os fármacos antifúngicos foram realizadas usando o método de tabuleiro de xadrez. Para análise do efeito das alterações morfológicas causadas pela combinação de epiisopiloturina/anfotericina B em Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428, foram obtidas imagens utilizando microscopia de força atômica. Dos alcaloides testados, o cloridrato de pilocarpina e a pilosina apresentaram atividade antifúngica para Fonsecaea pedrosoi e Trichophyton rubrum, respectivamente (CIM = 256 μg/mL). A interação da pilocarpina com a terbinafina se mostrou sinérgica (IFCI = 0,03 – 0,5) para todos os fungos testados. Essa mesma associação se mostrou sinérgica para cinco, dos oito isolados de agentes da ceratite fúngica filamentosa avaliados. A epiisopiloturina, não apresentou atividade antifúngica (CIM > 256 μg/mL) contra os agentes da cromoblastomicose. No entanto, as associações da mesma com a terbinafina ou com a anfotericina B foram sinérgicas contra estes últimos. Nenhuma das combinações realizadas teve efeito antagônico. A análise das imagens obtidas por microscopia de força atômica mostrou que as hifas de Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428 foram completamente destruídas pela associação de epiisopiloturina com a anfotericina B. Os resultados obtidos com os testes de susceptibilidade e análise das combinações nos permitem sugerir um mecanismo de ação para a epiisopiloturina, onde a mesma agiria intracelularmente, dependendo da desestruturação da membrana plasmática para poder atuar. Este trabalho traz resultados promissores para a terapia antifúngica, especialmente para o tratamento da cromoblastomicose e da ceratite fúngica filamentosa, em que a combinação dos alcaloides cloridrato de pilocarpina e epiisopiloturina com agentes antifúngicos poderia reduzir o aparecimento da resistência ao passo que diminuiria a toxicidade causada por estes últimos. ABSTRACT: Fungal infections play an important role in human morbidity and mortality. Despite this, researches aimed at finding therapies or drugs that are more effective and safer still lagged in comparison with diseases caused by other pathogens. Among the infections caused by fungi, can be mentioned chromoblastomycosis and filamentous fungal keratitis. The first is a polymorphic disease that occurs due to traumatic implantation of dematiaceous fungi. The latter is an ocular infection where suppurative corneal ulceration occurs and can lead to blindness. Both diseases present an increasing number of refractory cases to the treatments. In this way, the search for new molecules is needed, as well as optimization of current pharmacotherapy. Plants are important and promising source of new drugs. The species Pilocarpus microphyllus, popularly known as „jaborandi‟, is a native plant of North and Northeast regions of Brazil. Several alkaloids were isolated from this plant, among them, pilocarpine and epiisopiloturine. These, present some pharmacological activities already described in the literature. Yet, they lack in analysis regarding its antifungal activity. This study aimed to evaluate the fungal susceptibility to alkaloids obtained from „jaborandi‟ leaves, using in vitro assays, along with their interaction with antifungal agents. Initially, a prospection of antifungal activity was carried out with the alkaloids pilocarpine, isopilocarpine, epiisopilosine, isopilosine e pilosine against pathogenic fungi (n = 10), including representatives of dermatophytes, chromoblastomycosis and sporotrichosis agents, as well as isolates of the genera Aspergillus, Candida and Cryptococcus. From these results, pilocarpine was selected to evaluate its effect in association with terbinafine against the same fungal isolates and against isolates agents of filamentous fungal keratitis (n = 8). Epiisopiloturine was analysed for its profile of antifungal activity, as well as its interaction with four antifungal drugs (itraconazole, posaconazole, terbinafine and amphotericin B) against chromoblastomycosis agents (n = 19). Susceptibly tests were conducted according to the microdilution techniques proposed in the protocols M27-A3 and M38-A2 by Clinical and Laboratory Standards Institute. The interaction of the alkaloids with antifungal drugs were carried out using the chessboard technique. Morphologic alterations caused by epiisopiloturine/amphotericin B combination on Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428, were analyse through atomic force microscopy images. Of the alkaloids tested, pilocarpine hydrochloride and pilosine showed antifungal activity for Fonsecaea pedrosoi and Trichophyton rubrum, respectively (MIC = 256 μg/mL). The association of pilocarpine with terbinafine was synergic (FICI = 0,03 – 0,5) for all the tested isolates. The same association showed synergic activity for five, among of the eight isolates of filamentous fungal keratitis tested. Epiisopiloturine, did not present fungal activity (MIC > 256 μg/mL) against chromoblastomycosis agents. Its association with terbinafine, amphotericin B, however, was synergic for the latter. None of the combinations analysed showed antagonism effect. Images analyses obtained by atomic force microscopy exhibit hyphae completing destroyed by the association of epiisopiloturine/amphotericin B. The results obtained with the susceptibility tests and analyses of the combinations allowed us to suggest an action mechanism for epiisopiloturine, where it would act intracellularly, depending on the plasmatic membrane disruption to be able to act. This study brings promising results for antifungal therapy, especially for treatment of chromoblastomycosis and filamentous fungal keratitis, in which the combination of the alkaloids pilocarpine and epiisopiloturine could reduce the emergence of resistance while decreasing the toxicity presented by current treatments.