TESTE RÁPIDO PARA DETECÇÃO DA INTERLEUCINA 6 E IDENTIFICAÇÃO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE VISCERAL GRAVE

Abstract

RESUMO: Os ensaios de fluxo lateral, do inglês “Lateral Flow Assay” (LFA) ou teste de tira, são utilizados há algumas décadas como testes rápidos. Desde o surgimento das primeiras tiras, na década de 70, a qualidade e intensidade do sinal colorimétrico melhoraram com o advento da nanotecnologia. O diagnóstico e controle de doenças, principalmente as negligenciadas, frequente nos países em desenvolvimento, vem sendo o alvo principal de tecnologias, como a imunocromatografia. A Leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave, letal que afeta 12 milhões de pessoas em 98 países. Clinicamente a enfermidade é caracterizada como um protótipo de disfunção imune específica e em resposta uma gama de interleucinas são acionadas, elevando os seus níveis séricos. A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina multifuncional que desempenha papel-chave não apenas no sistema imunológico, mas também em uma variedade de processos biológicos. Na LV esta citocina está relacionada a fatores de gravidade e óbito. Este estudo teve como objetivo deselvolver um dispositivo simples para detecção rápida da IL-6 e identificação de pacientes com LV grave. Duzentos e trinta e cinco pacientes com suspeita clínica de LV tiveram sangue e medula óssea coletados para confirmação diagnóstica da doença. Cento e um pacientes tiveram diagnóstico confirmado para LV por pesquisa direta ou cultura. Amostras de plasma foram quantificadas para IL-6 por citometria de fluxo e tecnologia LFA. A concentração média do IL-6 no grupo de estudo foi 232,8 pg/mL e esteve associada a fatores de gravidade da LV tais como sepse, sangramento e óbito. Pacientes com maior probabilidade de morte apresentaram níveis mais elevados de IL-6 e proteína C-reativa (p < 0,0001 e p = 0,0367, respectivamente). O aumento de IL-6 também esteve positivamente correlacionado ao aumento da proteína C-reativa (r = 0,6997; p < 0,0001). O melhor modelo de montagem do teste LFA deu-se em função das características do plasma humano e o cromógeno de marcação foi a nanopartícula de ouro (AuNPs) com diâmetro médio de 14 nm. O teste de agregação do anticorpo AuNPs/Anti-IL-6 mostrou-se satisfatório para as concentrações de 200,0 a 800,0 μg/mL. Para validação do teste LFA montou-se uma curva padrão com a proteína IL-6 recombinante (0 – 10.000 ng/mL) a qual mostrou-se linear com coeficiente angular de inclinação de 0,005 x 4,42 e coeficiente de correlação, 0,987 e LD 0,72 ng/mL. A curva padrão com 800,0 μg/mL de Anti-IL-6 no conjugado mostrou ser reprodutível (SD = 0,16; SE = 0,08). O coeficiente de repetitividade para as duplicatas foi de 76,8%. Amostras reais mensuradas em três condições diferentes, evidenciaram que quanto maior a concentração de anti-IL-6 no conjugado, maior o número de amostras positivas e correspondentes visualmente com a curva padrão para a proteína pura. O fluxo de amostra foi satisfatório para 88,9% das amostras. Niveis de IL-6 mensurados por citometria de fluxo mostraram-se correlacionados com a tecnologia LFA (r = 0,2218; p = 0,0159). Foram realizados testes de seletividade com as citocinas IL-8, IL-10 e IL-12 e não houve marcação em nenhum dos testes. O dispositivo simples, LFA, denominado Quick-IL test (IL-6), mostrou-se sensível, específico e seletivo. O método semiquantitativo mostrou-se eficaz para caracterização de pacientes com LV grave. O aplicativo de leitura para dispositivos móveis captura, processa e quantifica as imagens comparando com a escala de cor padrão, considerando interferentes ambientais. ABSTRACT: Lateral flow assay (LFA) or strip test, have been used for decades as quick tests. Since the first strips, in the 1970’s years, quality and intensity of the colorimetric signal have improved with the advent of nanotechnology. Diagnosis and control of diseases, especially neglected diseases, common in developing countries, has been the main target of technologies, such as immunochromatography. Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious, lethal disease that affects 12 million people in 98 countries. Clinically the disease is characterized as a prototype of specific immune dysfunction and in response, cytokines are increased. Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that plays a key role not only in the immune system but also in a variety of biological processes. In VL, it´s correlated with severe factors and death. This study aimed to develop a simple device for quick detection of IL-6 and identification of severe VL. Two hundred and thirty-five patients with clinical suspicion of VL had blood and bone marrow collected. One hundred and one patients had VL confirmed by direct research or culture. Plasma samples were quantified for IL-6 by CBA and LFA technology. The mean IL-6 concentration in the study group was 232.8 pg / mL and are associated with severe VL and factors such as sepsis, bleeding, and death. Patients with higher probability of death had higher levels of IL-6 and C-reactive protein (p < 0.0001; p = 0.0367, respectively). IL-6 was positive correlated with C-reactive protein (r = 0.6997; p < 0.0001). The best model of the LFA test was based on gold nanoparticle (AuNPs) for chromogen detection. The mean diameter of AuNPs were14 nm. Antibody aggregation test, AuNPs/Anti-IL-6 were satisfactory at concentrations 200.0 to 800.0 μg/ml. Validation LFA test were made by standard curve with the recombinant IL-6 protein (0 - 10,000 ng/mL) which linear slope coefficient (0.005 x 4.42) and correlation coefficient, 0.987. The standard curve with 800.0 ng/mL of Anti-IL-6 on conjugate was reproducible (SD = 0.16; SE = 0.08). The repeatability coefficient for the duplicates was 76.8%. Samples measured in three different conditions, showed higher concentration of anti-IL-6 in the conjugate, results the greater number of positive samples and visual correspondence with the standard curve. Samples had constant flow for 88.9% of the tests. IL-6 levels measured by CBA were correlated with LFA technology (r = 0.2218; p = 0.0159). Selective tests were performed by cytokines IL-8, IL-10 and IL-12 and there was no labeling in any of the tests. LFA device, Quick-IL test (IL-6), was sensitive, specific and selective. The quantitative method proved to be effective to characterize severe VL patients. The smartphone devices for IL-6 interpretation of results, captures, processes and quantifies the image by comparing it with the standard color scale, considering environmental interferers.